Akceptuję
W ramach naszej witryny stosujemy pliki cookies w celu świadczenia państwu usług na najwyższym poziomie, w tym w sposób dostosowany do indywidualnych potrzeb. Korzystanie z witryny bez zmiany ustawień dotyczących cookies oznacza, że będą one zamieszczone w Państwa urządzeniu końcowym. Możecie Państwo dokonać w każdym czasie zmiany ustawień dotyczących cookies. Więcej szczegółów w naszej Polityce Prywatności

Zamknij X
Strona główna Artykuły

Mikrosatelitarne sekwencje DNA – źródłem zmienności genomów?

Wstęp 

  W ciągu ostatnich 10 latach dowiedziono wiele osiągnięć w dziedzinie genomiki, której celem jest poznanie sekwencji materiału genetycznego oraz określenie wszelkich zależności i interakcji wewnątrz genomu. Najnowsze wyniki dowodzą, że w sekwencjonowanych genomach organizmów prokariotycznych, jak i eukariotycznych znajdują się obszary posiadające dużą liczbę różnych jedno-, dwu-, trój-, cztero-, a także pięcionukleotydowych sekwencji. Powtórzenia takich sekwencji mających zróżnicowaną oraz zmienną wielkość nazywane są sekwencjami mikrosatelitarnymi, bądź też prostymi sekwencjami powtórzonymi [1]. 

Do dzisiejszego dnia funkcjonuje zaproponowany w 1953 roku przez Jamesa Watsona i Francisa Cricka model struktury typu B - DNA, który przedstawia podstawową formę DNA, powszechnie występującą w komórkach każdego organizmu. W strukturze tej dwa łańcuchy DNA, są ułożone przeciwrównolegle, tworząc prawoskrętną helisę o dokładnie sprecyzowanych parametrach fizykochemicznych. James Watson wraz z Francisem Crickiem i Rosalindą Franklin, która wykazała, że DNA ma strukturę spiralną, opracował w Laboratorium Cavendisha model budowy przestrzennej podwójnej helisy DNA. Za to razem z F. Crickiem i Maurice’em Wilkinsem, otrzymał nagrodę Nobla w 1962 roku w dziedzinie fizjologii. Następnie w 1977 roku Frederick Sanger odkrył terminację łańcucha sekwencjonowania DNA. Technologia ta pozwala naukowcom czytać sekwencję nukleotydową cząsteczki DNA. W 1983 roku Kary Banks Mullis dokonał odkrycia reakcji łańcucha polimerazy dostarczając łatwy sposób do izolacji i wzmocnienia specyficznej sekcji DNA z mieszanki. W ramach projektu The Human Genome Project oraz innych badań w 2003 roku zsekwencjonowano cały genom człowieka [1]. 

Przez 50 lat prowadzono wzmożone badania strukturalne i funkcjonalne używając fragmentów restrykcyjnych, syntetycznych oligomerów, a także naturalnych i rekombinowanych cząsteczek DNA. Istotne rezultaty przyniosły cząsteczki DNA, cechujące się obecnością różnych sekwencji powtórzonych. Wynikiem tego były dowody potwierdzające, że określone regiony kwasu deoksyrybonukleinowego mogą przyjmować w warunkach in vitro i in vivo struktury inne niż kanoniczna forma B – DNA [1]. 

W komórce w postaci B - DNA, a także w konformacji innej od B - DNA mogą występować regiony zawierające sekwencje zdolne do przyjmowania alternatywnej struktury. Stan tej aktualnej równowagi zależny jest od motywu sekwencji danego powtórzenia, lokalizacji w genomie, a także jego długości. W procesie powstawania struktur odmiennych od B - DNA istotną rolę odgrywa też stan metylacji zasad azotowych, wewnątrzkomórkowe stężenie jonów, białek i ligandów wiążących DNA, stan fizjologiczny komórki oraz globalna i lokalna gęstość superhelikalna DNA. Wynika ona z procesów metabolicznych zachodzących w cząsteczce DNA (np. transkrypcja, replikacja) oraz z aktywności topoizomeraz komórkowych. Dotychczas wykryto i szczegółowo scharakteryzowano warunki tworzenia ponad 10 różnych typów DNA. Zaliczamy do nich między innymi: lewoskrętny Z-DNA, trójniciowy H-DNA, czteroniciowy DNA, strukturę krzyżową i strukturę ślizgową (strukturę „spinki do włosów”), zagięty DNA oraz lepki DNA [2]. 

Do ważnych zmian procesów komórkowych na poziomie rekombinacji, replikacji oraz transkrypcji mogą doprowadzać przekształcenia struktury DNA in vivo. Nowe informacje dotyczące biologicznej roli trwałych struktur odmiennych od kanonicznej formy B-DNA, przyjmowanych przez naturalne sekwencje powtórzone, przyczyniły się do niezmiernie dużego postępu w medycynie, biologii molekularnej, genetyce, głównie w dziedzinie proteomiki oraz genomiki. Udowodniono, że struktury tego typu mogą wykonywać funkcje wewnątrzkomórkowych mutagenów. Skutki mogą przyczynić się do pojawiania się różnych mutacji, w tym mutacji dynamicznych, ekspansji (wzrostu liczby powtórzeń w kolejnych pokoleniach), delecji oraz innych dezorganizacji w genomach organizmów żywych [2]. 

 Charakterystyka mikrosatelitarnych sekwencji DNA 

  DNA może przyjmować różne struktury odmienne od B – DNA. Wyniki badań in vitro przeprowadzonych przy użyciu syntetycznych oligomerów, rekombinowanych cząsteczek oraz fragmentów restrykcyjnych wykazały, że zależy to od rodzaju sekwencji nukleotydowej, gęstości superhelikalnej cząsteczki oraz innych czynników wewnątrzkomórkowych [3]. Koniecznym warunkiem dla utworzenia formy lewoskrętnej Z-DNA jest powstawanie w rejonach powtórzonych sekwencji naprzemiennie purynowo-pirymidynowych (RY•RY)n. R oznacza zasadę purynową (A lub G). W tych obszarach genomów gdzie znajdują się dwa rodzaje sekwencji powtórzonych: (CG•CG)n oraz (CA•TG)n może tworzyć się struktura Z-DNA. W przeciwieństwie do B-DNA, w którym występuje mała i duża bruzda, w lewoskrętnej helisie Z-DNA znajduje się wyłącznie mała bruzda. Porównując, w B-DNA pełny skręt helisy w prawo obejmuje 10,5 par zasad azotowych, natomiast w Z-DNA pełny skręt helisy w lewo o 360° obejmuje 12,5 par zasad azotowych. Takie odchylenie w strukturze helikalnej DNA, ma nie bez znaczenia następstwa biologiczne na skutek zmiany charakteru oddziaływań białek komórkowych, w tym także białek regulatorowych, z formą Z-DNA [3]. 

Struktury trójniciowe powstają poprzez przyłączenie trzeciej nici leżącej w dużej bruździe dwuniciowej helisy B-DNA. Wewnątrzcząsteczkowy trójniciowy DNA może tworzyć się w rejonach traktów oligopurynowo-oligopirymidynowych (R•Y)n. W skład trzeciej nici wchodzą zasady azotowe, które są połączone z nicią purynową helisy B -DNA za pomocą wiązań wodorowych typu Hoogsteena. W omawianej strukturze trzecią nicią może być łańcuch oligopurynowy, jak i oligopirymidynowy, ponieważ nić purynowa helisy B-DNA wiąże się wiązaniami Hoogsteena z jednym oraz z drugim rodzajem zasad azotowych [3,4]. Wyróżnia się dwa typy trójniciowego DNA: jeden w trzeciej nici zawiera pirymidyny (Y:R-Y), a drugi puryny (Y:R-R), gdzie znak (-) oznacza wiązanie Hoogsteena, a (:) – wiązanie Watsona-Cricka. Trzecia nić wiąże się z nicią purynową B-DNA na zasadzie komplementarności zasad. W pierwszym przypadku tworzą się wiązania wodorowe pomiędzy trójkami zasad T:A-T i C:G-C, w drugim pomiędzy T:A-A oraz C:G-G. W obszarze sekwencji oligopurynowo-oligopirymidynowych najłatwiej tworzy się struktura trójniciowego DNA. Sekwencje te uzupełniająco spełniają warunek sekwencji powtórzonych z symetrią typu lustrzanego odbicia, gdyż odczytywane w kierunku 5', jak i w kierunku 3' są identyczne. W tym przypadku mechanizm tworzenia tripleksu obejmuje etap zagięcia dupleksu B-DNA w połowie tej sekwencji, jest to miejsce wyznaczone przez oś jej symetrii. Kolejny etap polega na rozpleceniu dupleksu w tym regionie i wniknięciu jednej z nici (pełniącej funkcję trzeciej nici) w dużą bruzdę helisy DNA. W tym obszarze nić do niej uzupełniająca pozostaje niesparowana [3,5]. 

Struktury krzyżowe powstają w obszarach posiadających sekwencje odwrócone (IR). Posiadają one cechy palindromów, co sprawia, że poszczególne nukleotydy są do siebie komplementarne w rejonie naprzeciwległych nici oraz wewnątrz obu z nich, względem osi symetrii, która wyznacza środek sekwencji. Istnieje możliwość lokalnego rozerwania wiązań wodorowych dupleksu DNA, a następnie alternatywnego i stabilnego parowania w warunkach podwyższonej gęstości superhelikalnej. W tak sparowanym obszarze na obu niciach powstaje wtedy trzonek, a także obejmująca środek symetrii pętla, w której obrębie nukleotydy pozostają niesparowane. Minimalna wielkość pętli jest uwarunkowana giętkością DNA. Za pomocą tego parametru ustala się limit odległości pomiędzy komplementarnymi nukleotydami położonymi po obu stronach osi symetrii, które są zdolne wytworzyć wiązania wodorowe. Kiedy jest pełna komplementarność zasad w obrębie palindromu, liczba ta waha się od 3-4 nukleotydów. Duże palindromy mające mocno zaburzoną komplementarność w centralnej części obszaru mogą posiadać pętle, które zajmują wiele tysięcy par zasad [3,6]. 

W rejonach genomów, które są bogate w proste powtórzenia (DR) istnieje możliwość różnego parowania się uzupełniających kopii powtórzonych sekwencji nukleotydów. W wyniku tego może dochodzić do wytworzenia w tych obszarach jednoniciowych pętli, określanych jako struktury ślizgowe. Wykazano, że te typy konformacji przestrzennych są łatwo tworzone w regionach, posiadających różne czynniki wielokrotnie powtórzonych sekwencji trójnukleotydowych (CTG•CAG, CGG•CCG, GAA•TTC, GAC•GTC), czteronukleotydowych (CCTG•CAGG) lub pięcionukleotydowych (ATTCT•AGAAT) oraz sekwencji telomerowych. W skutek parowania się w cząsteczce DNA odległych od siebie uzupełniających się kopii takich powtórzeń jest możliwość two-rzenia się rozległych, jednoniciowych wypętleń. W obrębie takich wypętleń istnieje możliwość dodatkowego formowania struktur innych niż B-DNA, na przykład lepkiego DNA w przypadku sekwencji (GAA)n bądź struktury „spinki do włosów" w przypadku sekwencji (CTG)n [3,7].

  • Występowanie i rola biologiczna eukariotycznych mikrosatelitarnych sekwencji DNA 

Różnorodne sekwencje mikrosatelitarne występują z dużą częstością w genomach organizmów eukariotycznych, w tym człowieka. Głównie znajdują się one w niekodujących regionach DNA. Poszczególne rodzaje mikrosatelitów występują z różną częstością u rozmaitych gatunków. Tego typu sekwencje u organizmów eukariotycznych znajdują się 5-10 razy częściej niż inne, przypadkowe sekwencje DNA. Na istotną rolę biologiczną tych sekwencji DNA, które biorą udział w kształtowaniu struktury i funkcji genów zasadniczy wpływ ma rozpowszechnienie występowania i filogenetyczny konserwatyzm powtórzeń typu SSR. Ważną funkcję spełniają także: polimorfizm wielkości, różnorodność motywów, niestabilność genetyczna, a także określona lokalizacja w genomie. Ostatnie 20 lat świadczy o ukazywaniu się coraz to większej ilości pośrednich, jak i bezpośrednich dowodów potwierdzających ważność konsekwencji biologicznych. Są one efektem zmian liczby powtórzeń w obszarze różnych sekwencji mikrosatelitarnych. Po raz pierwszy informacji na ten temat dały badania kilku genów drożdży dzikich i ich mutantów. Udowodniono, że trakty powtórzeń typu (T)53 i (T)54, które leżą w obszarze regionu promotorowego genu ADR2 badanych konstytutywnych mutantów, niewątpliwie dały 5-krotnie wydajniejszą transkrypcję genu w porównaniu ze szczepem dzikim drożdży, gdzie trakt ten zawierał 20 powtórzeń [3,8]. 

Znaczne osiągnięcia zaobserwowano w zrozumieniu związków pomiędzy naturą chemiczną powtarzających się sekwencji DNA, mających zdolność do tworzenia struktur przeciwstawnych od kanonicznej formy B-DNA, a następstwami biologicznymi obecności w komórkach takich konformacji. Postęp ten jest w dużym stopniu związany z wielokierunkowymi badaniami przyczyn powstawania grupy neurodegeneracyjnych genetycznych chorób człowieka, których przyczyną jest niestabilność trójnukleotydowych powtórzeń (TRS) typu (CTG•CAG)n, (CGG•CCG)n i (GAA•TTC)n. Do schorzeń takich zaliczamy między innymi: pląsawicę Huntingtona (HD), dystrofię miotoniczną (DM), różnego rodzaju zaburzenia móżdżkowo-rdzeniowe (SCA), rdzeniowy i opuszkowy zanik mięśni typu Kennedy'ego (SBMA), ataksję Friedreicha, zwyrodnienie zębato-czerwienne (DRPLA) oraz zespoły łamliwego chromosomu X (FRAXA, FRAXAE, FRAXA16A, FRA11B. Brak stabilności w powyżej wymienionych ludzkich powtórzonych traktów typu TRS zapoczątkowuje procesy odpowiedzialne za ich rozprzestrzenianie w następnych pokoleniach. Co raz więcej informacji pojawia się na temat chorób genetycznych człowieka związanych z ekspansjami innych powtó-rzonych traktów takich jak: (CCTG•CAGG)n dystrofia miotoniczna typu 2, (CCCCGCCCCGCG)n w jednym z rodzajów epilepsji, (ATTCT•AGAAT)n w ataksji móżdżkowo-rdzeniowej typu 10 (SCA 10). Ulegające ekspansjom powtórzenia znajdują się w obszarach kodujących białko, intronach, sekwencjach 5' i 3' nie ulegających translacji, a także w obrębie regulatorowych genów. Ekspansje w obszarach niekodujących nie przekraczają nawet 100-160 powtórzeń (np. choroby Huntingtona i Machado-Josepha). Ekspansje w innych rejonach genów mogą dochodzić do kilku bądź do kilkunastu tysięcy powtórzeń, dotyczy to przypadku dystrofii miotonicznej typu 2, choroby Fredreicha, ataksji móżdżkowo-rdzeniowej typu 10 oraz zespołu kruchego chromosomu X [3,9]. Jednym z głównych kryteriów podziału chorób na typy jest wielkość i lokalizacja powtórzeń ulegających ekspansjom. Wyróżnia się typ I - ekspansje dochodzące od kilku do kilkudziesięciu powtórzeń i typ II - rozległe ekspansje w obszarach nie ulegających translacji. Brak stabilności innych typów ludzkich sekwencji powtórzonych, w tym głównie prostych i odwróconych powtórzeń, a także traktów homopurynowo-homopirymidynowych, jest udokumentowany dla co raz większej liczby chorób genetycznych człowieka. Przyczyną tych chorób są inwersje, delecje i translokacje w różnych genach, wytwarzane przez sekwencje powtórzone. Przykładem takiej nieuleczalnej choroby człowieka jest wielotorbielowatość nerek, której przyczynę obserwuję się w genetycznej niestabilności fragmentu DNA o długości 2,5 tys. par zasad, położonego w intronie genu PKD1, bogatego w trakty (R•Y), DR oraz IR. W doświadczalnych warunkach pobudzają pojawianie się mutacji punktowych, translokacji, delecji, a także innych rearanżacji DNA [3,10]. Ważną rolę biologiczną SSR oraz tworzonych przez nie struktur odmiennych niż B -DNA pełnią ludzkie sekwencje (GAA•TTC)n, których niestabilność leży u podłoża ataksji Friedreicha. Na podstawie badań eksperymentalnych udowodniono, że ekspansje sekwencji, które są zdolne do tworzenia trwałych struktur typu tripleksu, tetrapleksu, bądź lepkiego DNA, wpływają na hamowanie transkrypcji genu kodującego białko - frataksynę [3,11]. Wykazano, że stabilne alternatywne struktury drugorzędowe, tworzone w obszarach sekwencji SSR, głównie typu (R•Y), IR, a także TRS, stanowią miejsce częstych pęknięć DNA. Pojedyncze i podwójne pęknięcia DNA indukują natomiast procesy rekombinacji homologicznej oraz inne mechanizmy naprawy DNA, co skutkuje różnorodnymi i częstymi mutacjami w obszarze tych powtórzonych traktów [3,6]. 

W kilkudziesięciu genach, które odpowiadają za syntezę czynników transkrypcyjnych odkryto powtórzone sekwencje (CAG)n. Kodują one długie ciągi poliglutaminowe mające długość 20 i więcej reszt aminokwasowych. Poliglutaminowe trakty zaobserwowano między innymi w białkach Saccharomyces cerevisiae i Drosophila, które rozpoznają sekwencję TATA, a także w białku receptorowym androgenu. Jest oczywiste, że ciągi poliglutaminowe mające określoną długość, ulokowane w białkach wiążących DNA, pełnią istotną rolę jako regulatory transkrypcji genów. Przyczyną wielu chorób neurodegeneracyjnych są znaczne ekspansje traktów (CAG)n w określonych genach człowieka, które prowadzą do utraty funkcji, lub do zmiany funkcji kodowanych białek [3,12]. 

Sekwencje SSR cechuje genetyczna niestabilność przez zdolność do zmiany liczby powtórzeń. Ujawnia się ona wyjątkowo widocznie w postaci częstych spontanicznych mutacji dynamicznych, które obejmują zmiany liczby powtórzeń w danych loci. W obszarze określonego locus, zarówno u różnych osobników danego gatunku jak i w całych populacjach, ujawnia się polimorficzna natura sekwencji SSR. Mechanizm replikacji sekwencji SSR jest przyczyną ich niestabilności, ponieważ w rejonie tego typu sekwencji możliwe jest ślizganie się nici matrycowej w wyniku czego dochodzi do błędnego parowania zasad [3,13]. 

W ostatnich latach pojawia się wiele nowych informacji dotyczących biologicznej roli sekwencji mikrosatelitarnych zdolnych do tworzenia struktur trójniciowych. W genomie człowieka od ponad 20 lat rozpoznano długie ciągi (R•Y) zbudowane z kilkuset nukleotydów. Skrupulatne badania w celu wyjaśnienia lokalizacji tego rodzaju sekwencji i innych SSR w genomie człowieka i zwierząt oraz ustalenie ich roli biologicznej wzmożyły się z chwilą rozszyfrowania pełnej sekwencji nukleotydowej genomu człowieka, naczelnych oraz innych kręgowców. Genom człowieka, podobnie jak szympansa i myszy, posiada tysiące kopii różnych sekwencji typu (R•Y). W genomie ludzkim zlokalizowano ponad 65 tysięcy kopii powtórzonych sekwencji dwunukleotydowych, około 30 tysięcy kopii czteronukleotydowych i 6700 kopii powtórzeń trójnukleotydowych, mających długość 15 nukleotydów i nawet więcej. Bardzo interesujące wyniki osiągnięto poszukując sekwencji (RY), które dodatkowo spełniają warunek symetrii lustrzanego odbicia. Tego typu trakty mające budowę 30 i więcej nukleotydów, najłatwiej tworzą stabilne struktury tripleksu. W ludzkim genomie zlokalizowano 2200 kopii (GGAA•TTCC)n, 3200 kopii sekwencji (GAAA•TTTC)n, a także 2400 kopii (GA•TC)n. Genom człowieka posiada aż 814 powtórzeń homopurynowo-homopirymidynowych zbudowanych z 250 i więcej nukleotydów. Taka informacja utwierdza w przekonaniu o spełnianych przez nie funkcjach biologicznych [3,14]. 

Wykazano, że są one preferencyjnie zlokalizowane w obszarach pseudoautosomalnych chromosomów X i Y, gdzie przebywają w intronach 228 genów, kodujących ekspresję białek mających związek ze strukturą oraz funkcją membran komórkowych. Szczegółowa bioinformatyczna analiza tych genów pokazuje, że podlegają one wydajnej ekspresji w mózgu. Przypuszcza się, że zaburzenia ekspresji wielu z nich mogą przyczyniać się na przykład do rozwoju schizofrenii. Białka uczestniczące w procesach fosforylacji, transdukcji sygnałów, morfogenezy oraz rozwoju koduje około 2 tysięcy innych genów, posiadających około 3 tysięcy sekwencji (R•Y) zbudowanych ze 100, a nawet więcej nukleotydów. Porównawcza analiza bioinformatyczna długich traktów (R•Y) w genomie człowieka, szympansa i myszy wpłynęła na wyciągnięcie wniosku, że trakty te podlegają procesom mutacji o wiele częściej aniżeli inne sąsiadujące z nimi sekwencje DNA [3,15]. 

Można zastanowić się czy w omawianych sekwencjach mikrosatelitarnych genetyczna niestabilność wynika z pierwszorzędowej struktury poszczególnych motywów powtórzonych sekwencji nukleotydowych czy przyczyny niestabilności należy doszukiwać się w ich zdolności tworzenia in vivo struktur DNA odmiennych niż prawoskrętny B-DNA. Trwające wiele lat badania na temat niewykluczonej roli biologicznej takich struktur tworzonych w regionach sekwencji SSR wykazują, że mogą one pełnić w żywej komórce ważną rolę. Dotyczyć to będzie inicjacji procesu replikacji DNA, regulacji ekspresji różnych genów, w mutagenezie, destabilizacji genomu oraz w stabilizacji końców chromosomów i globalnej organizacji chromatyny [3,6]. Sekwencje mikrosatelitarne mają możliwość kodowania domeny białek o nowej funkcji biologicznej, mogą też odgrywać rolę regulatorów i modulatorów transkrypcji wielu różnych genów w zależności od lokalizacji i natury chemicznej. Powstawanie w ich obszarze struktury odmiennej od B-DNA jest przyczyną różnych mutacji, w tym związanych z ontogenetyczną oraz filogenetyczną zmianą liczby powtórzeń. Mutacje mające związek z całkiem niewielką zmianą liczby powtórzeń SSR, w określonych loci, mogą ujawniać się w postaci dużych zmian aktywności genów, jak i funkcji biologicznej ich produktów, co prowadzi do zmiany fenotypów. Udowodniono też, że częstość mutacji, mających związek ze zmianą liczby powtórzeń, jak i z inwersjami, dużymi delecjami i innymi rearanżacjami, może zależeć od orientacji traktu względem kierunku replikacji. Wzmagana jest też ona na skutek dysfunkcji systemów naprawy błędów i uszkodzeń DNA oraz mutacji w genach kodujących syntezę topoizomeraz DNA i w warunkach intensywnej transkrypcji [3,7].

  • Powstawanie struktur odmiennych niż forma B-DNA 

W końcu lat osiemdziesiątych XX wieku wykazano, że prawoskrętna forma B i lewoskrętna forma Z występują w równowadze w plazmidowym DNA Escherichia coli. Położenie równowagi uzależnione jest od długości sekwencji podlegających przemianom B do Z. W E. coli Z-DNA tworzy się bez udziału czynników zewnętrznych, natomiast ilość konformeru Z-DNA wzrasta podczas transkrypcji [3]. 

Wykazano, że zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo metylaza EcoRI nie rozpoznaje i nie metyluje swej docelowej sekwencji GAATTC tylko wtedy, gdy ta znajduje się w regionie traktu (CG), zawierającego 4 a nawet więcej powtórzeń. Przy wykorzystaniu innych metod udało się uwiarygodnić obecność in vivo struktury Z-DNA oraz odkryć strukturę trójniciową w komórkach prokariotycznych i eukariotycznych [3]. 

Jedynie w warunkach wysokiej negatywnej gęstości superhelikalnej DNA, w żywej komórce odbywa się tworzenie wyjątkowych alternatywnych struktur oraz ich stabilizacja. Za pomocą eksperymentu wymuszono zmiany negatywnej gęstości superhelikalnej komórkowego bądź plazmidowego DNA, noszących trakty SSR, co pomogło przeanalizować częstość i rodzaj mutacji. Są one odpowiedzią komórki na tworzone in vivo różne alternatywne struktury DNA. W badaniach tych wykorzystano dwa mutanty E. coli, odpowiednio z mutacjami w genie topoizomerazy I i gyrazy (topA i gyrE). Pierwszy z mutantów generuje wysoką negatywną gęstość superhelikalną DNA, drugi natomiast znacznie niższą niż izogeniczny dziki szczep E. coli. Mutanty te transformowano plazmidami, które noszą ludzkie sekwencje powtórzone (CCTG•CAGG)n, (GAA•TTC)n, (CGG•CCG)n, (CTG•CAG)n. Następnie przeanalizowano ich mutageniczność poprzez pomiar częstości mutacji dynamicznych w obszarze wstawek oraz przez analizę dużych delecji, jakie powstają w takich rekombinowanych plazmidach. W wyniku tego wykazano, że częstość delecji w szczepie o wyższej gęstości superhelikalnej (topA) była 2—3-krotnie większa aniżeli w szczepie (gyrB) z niższą wartością negatywnego superskręcenia DNA. Udowodniono więc, że zmiany gęstości superhelikalnej DNA, jakie prowadzą do zmniejszenia bądź zwiększenia ilości niezwykłych struktur DNA in vivo, są silnie skorelowane z mutagenicznością badanych traktów [3,16]. 

W ostatnich latach wykazano mutageniczność niezwykłych struktur DNA również w komórkach eukariotycznych. Stwierdzono, że powtórzenia typu CTG•CAG, CCTG•CAGG i CGG•CCG, wprowadzone do komórek COS-7, odpowiadają za duże i częste delecje w obszarze rekombinowanych cząsteczek. Odmiennie od nich, rekombinowane plazmidy z traktami CAAVPTG, nie mające zdolności do tworzenia stabilnej struktury „spinki do włosów", w tych samych komórkach były replikowane w stabilny sposób. Można więc wywnioskować, że mutageniczność jest cechą struktur innych niż B -DNA, tworzonych przez te sekwencje w żywych komórkach, a nie sekwencji mikrosatelitarnych. Zbliżone wnioski wyciągnięto w stosunku do powtórzeń naprzemiennie purynowo-pirymidynowych, które zdolne są do tworzenia in vitro i in vivo struktury Z-DNA [3,17]. Powtórzenia te są bardzo niestabilne zarówno w komórkach eukariotycznych jak i bakteryjnych, indukując podwójne pęknięcia DNA, a w następstwie duże delecje. Istotne wnioski odnośnie biologicznej roli struktur odmiennych od B -DNA wynikają z porównawczej analizy sekwencji mikrosatelitarnych w genomie ludzkim. Udowodniono, że w genomie człowieka odkryto około 6000 kopii czteronukleotydowych sekwencji GAAA•TTTC zawierających 8 i więcej powtórzeń, lecz brak jest nawet pojedynczych kopii tego typu traktów sekwencji ACGT•ACGT, AGCG•CGCT oraz ATCG•CGAT. Wyniki krzywych temperatur topnienia dupleksów takich sekwencji, a także dichroizmu kołowego informują, że pierwsza z przedstawionych sekwencji nie tworzy stabilnej struktury „spinki do włosów", natomiast trzy następne takie struktury tworzą ją. Istnieje więc ścisły związek między możliwością tworzenia alternatywnych struktur drugorzędowych in vivo w obszarze przedstawionych sekwencji czteronukleotydowych, a ich bytnością w genomie człowieka. Przypuszcza się, że sekwencje mikrosatelitarne zdolne do tworzenia takich stabilnych struktur w czasie ewolucji zostały usunięte z genomu człowieka ze względu na ich mutageniczność, natomiast sekwencje pozbawione takich właściwości, pozostały jako niemutageniczne [3]. 

Mocnych dowodów wskazujących o roli biologicznej sekwencji mikrosatelitarnych dostarcza analiza powodów tworzenia się grupy około 50 chorób genetycznych człowieka. Przyczynami są rearanżacje i duże delecje, będące skutkiem pęknięć DNA w odległych od siebie regionach chromosomów. Na podstawie dokładnej analizy lokalizacji tych pęknięć udowodniono, że powstają one w zwięźle określonych loci chromosomów, wyłącznie w obszarach sekwencji mikrosatelitarnych zdolnych do tworzenia takich struktur jak: struktura krzyżowa, tripleks DNA, struktura ślizgowa, bądź struktura „spinki do włosów". Później są one rozpoznawane i naprawiane, przypuszczalnie przy udziale systemu niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), a także nie we wszystkich przypadkach na drodze rekombinacji homologicznej, co skutkuje rozległymi delecjami [3,6]. 

Podsumowując, sekwencje mikrosatelitarne stają się mutageniczne, gdy tworzą w warunkach in vivo stabilne struktury inne niż kanoniczna forma B- DNA natomiast nie są mutageniczne, kiedy egzystują w komórce w postaci prawoskrętnego B-DNA. Dane te uzyskano w oparciu o badania doświadczalne, w których wykorzystano komórki organizmów prokariotycznych i eukariotycznych dostarczających informacji dotyczących molekularnych mechanizmów będących przyczyną wielu chorób genetycznych człowieka oraz efekty porównawcze analiz opierające się na osiągnięciach bioinformatyki i genomiki [6].

  • Rola biologiczna prokariotycznych mikrosatelitarnych sekwencji DNA 

Sekwencje powtarzające są również rozpowszechnione w świecie bakterii, jednak ich udział procentowy jest stosunkowo niewielki w odróżnieniu od organizmów eukariotycznych. Najczęściej liczba powtórzeń w danym trakcie bakterii nie przekracza 50, natomiast w genomach organizmów eukariotycznych głównie roślin wyższych i ssaków, liczba ta uzyskuje wartość kilkuset lub więcej. Zależnie od gatunku bakterii, SSR położone są w otwartych ramkach odczytu lub w obszarach promotorowych genów, które odpowiadają za ekspresję istotnych białek. Wymienić tu należy: białka membranowe, adhezyny, białka systemu SOS, białka inwazyjne, enzymy restrykcji i modyfikacji oraz białka uczestniczące w syntezie pili płciowych i lipopolisacharydu (LPS). Bardzo wysoką niestabilnością genetyczną, charakteryzują się obszary bakteryjnych genomów, w których leżą SSR. W literaturze naukowej nazywane są one regionami mutatorowymi, to znaczy, że są one powodem częstych, dziedzicznych mutacji, które u bakterii odpowiadają za adaptacyjne zmiany fazowe [3,18]. 

Pod koniec lat 80.XX wieku po raz pierwszy zostały opisane zmiany fazowe u bakterii, spowodowane niestabilnością SSR w określonych genach. Dotyczyły one niestabilności powtórzonej sekwencji tandemowej i miały związek z antygenami powierzchniowymi patogennych bakterii Yersinia pseudotuberculosis, Neisseria gonorrhoeae i Haemophilus influenzae . W świecie bakterii jest powszechnie znany wyspecjalizowany mechanizm zmienności adaptacyjnej. Odznacza się on dużą częstością odwracalnych przekształceń strukturalnych, dotyczących przede wszystkim budowy antygenów powierzchniowych. Ten molekularny mechanizm funkcjonuje bez udziału rekombinacji i polega prawdopodobnie na ślizganiu się komplementarnych nici w czasie replikacji SSR. Gdy SSR jest zlokalizowany w ramkach odczytu genów, wtedy poślizg nici matrycowej lub nici nowo syntetyzowanej odpowiednio kieruje do delecji albo addycji, powodując mutacje typu zmiany ramki odczytu bądź tworzenie kodonów stop. Zmiany liczby powtórzeń w sekwencjach SSR leżących na końcach 5' genów, w obszarach sekwencji Shine-Delgarno, a także sekwencji -10 i -35, bezpośrednio wpływają na poziom ekspresji tych genów, który jest dostatecznie zróżnicowany [3,18]. 

Niektóre gatunki bakterii, które posiadają dość duże genomy, na przykład Escherichia coli lub Pseudomonas aeruginosa (odpowiednio 4,5 i 6,5 miliona par zasad) pozbawione są systemu regulacji zmian fazowych przy udziale SSR. Natomiast bakterie mające małe genomy o rozmiarach około 2 milionów par zasad (Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Helicobacter pylori, Campylobacter jejuni) posiadają bardzo rozbudowany system regulacji ekspresji genów. Przypuszcza się, że bakterie zawierające duże genomy mają inne, bardziej złożone dwu-składnikowe systemy regulacji ekspresji, kontrolujące, poprzez białka regulatorowe i sensorowe, transkrypcję genów istotnych szlaków metabolicznych odpowiadając na zmiany środowiska. Gatunki bakterii, mające zredukowane genomy do wielkości około 2 milionów par zasad są pozbawione tych systemów. Bakterie, które wytworzyły system regulacji zmian fazowych z udziałem SSR, są przeważnie komensalami. Charakterystyczną cechą tych gatunków jest naturalny stan kompetencji, tak więc można przypuszczać, że obszary ONA i geny które noszą SSR mogą być przenoszone pomiędzy takimi gatunkami z udziałem transformacji. Tą metodą mogą się one rozpowszechniać w ich populacjach [3,18]. 

Podsumowanie 

Mimo ogromnych osiągnięć wciąż brak jest odpowiedzi na wiele wątpliwości dotyczących zrozumienia zjawisk natury oraz roli biologicznej sekwencji mikrosatelitarnych zarówno u organizmów eukariotycznych, jak i bakterii oraz tworzonych przez nie struktur przestrzennych, odmiennych od B- DNA. Nie ma mocnego przeświadczenia, czy genetyczna niestabilność różnych sekwencji powtarzających się, w tym również mikrosatelitarnych, jest związana z ich podatnością tworzenia in vivo konformacji przestrzennych odmiennych od kanonicznej formy B -DNA, czy to właściwość tylko niektórych powtarzających się traktów o określonej liczbie powtórzeń. 

Nie ma też pewności, czy różne niezwykłe struktury drugorzędowe DNA wytwarzają podobne, lub odmienne typy i spektrum mutacji (duże i małe delecje, zmiany ramek odczytu, translokacje, ekspansje, inwersje), i która jest najbardziej mutagenną formą DNA. Brak jest także gwarancji, czy za mutageniczność niezwykłych struktur DNA biorą odpowiedzialność dwa często przytaczane mechanizmy: rekombinacja homologiczna w odpowiedzi na pęknięcia DNA w wyniku zatrzymania widełek replikacyjnych i ślizganie się matryc w czasie replikacji. 

W ostatnich latach wyniki w wielu publikacjach naukowych wskazują na wyjątkowo istotną rolę systemów naprawy DNA, rozpoznających jednoniciowe obszary w obrębie tworzonych struktur i pęknięcia nici. Wciąż prowadzone są dyskusje na temat roli systemu naprawy błędów replikacji (MMR), systemu naprawy przez wycinanie (NER), systemu niehomologicznej rekombinacyjnej naprawy NH oraz homologicznej rekombinacji. Formy odmienne od B -DNA są dość często definiowane jako wewnątrzkomórkowe mutageny. Zapewniają one filogenetyczną, a także adaptacyjną plastyczność i zmienność genomów. Jednak ich niestabilność genetyczna jest molekularną przyczyną wielu chorób genetycznych człowieka, w tym nowotworowych i neurodegeneracyjnych. Dotychczasowa wiedza dotycząca roli biologicznej różnych powtarzających się sekwencji DNA, które są obecne w genomie człowieka, a także innych organizmów, w tym bakterii, pozwala stwierdzić, że obszary genomów zbudowane z tego typu powtarzających się traktów DNA pełnią różne funkcje. Nie można ich tylko rozważać jako zbędny DNA. Nad badaniami różnych sekwencji mikrosatelitarnych poczyniono wiele postępów. Wciąż jednak jest daleka droga do całkowitego poznania mechanizmów ich genetycznej niestabilności. 

/Katarzyna Czuba/


Słowa kluczowe: mikrosatelitarne sekwencje DNA, struktury DNA, forma B-DNA, niestabilność genetyczna, mutacje, rola biologiczna. 

Literatura: 

  1. Wells R.D., Wartell R.M. Biochemistry of Nucleic Acids. Burton K., ed., Butterworth Publishers. Stoneham. MA 6. 1974, 41-64. 
  2. Wells R.D. Non-B DNA conformations, mutagenesis, and diseases. Trends Bioch. Sci. 2007. 32(6), 271-278. 
  3. Stączek P., Jaworski A. Rola biologiczna mikrosatelitarnych sekwencji DNA. Na pograniczu chemii i biologii. 2007. Tom XVIII, 113-134. 
  4. Zain R., Sun J.S. Do natural DNA triple-helical structures occur and function in vivo?. Cell. Mol. Life Sci. 2003. 60, 862-870. 
  5. Frank-Kamenentskii M.D., Mirkin S.M. Triplex DNA structures. Annu. Rev. Biochem. 1995. 64, 65-95. 
  6. Bacolla A., Wells R.D. Non-B DNA conformations, genomic rearrangements, and human disease. J. Biol. Chem. 2004. 279, 47411-47414. 
  7. Welle R.D., Dere R., Hebert M.L., Napierała M., Son L.S. Advances in mechanisms of genetic instability related to hereditary neurological diseases. Nucleic Acids Res. 2005. 33, 3785-3798. 
  8. Kashi Y., King D., Soller M. Simple sequence repeats as a source of quantitative genetic variation. Trends Genet. 1997. 13, 74-78. 
  9. Wells R.D., Ashizawa T. Genetic instabilities and neurological diseases. sec. ed. Elsevier-Academic Press. 2006. 
  10. Wells R.D. Unusual DNA structures. J. Biol. Chem. 1988. 263, 1095-1098. 
  11. Ohshima K., Montermini L., Wells R.D. Inhibitory effects of expanded GAA • TTC triplet repeats from intron I of the Friedreich ataxia gene on transcription and replication in vivo. J. Biol. Chem. 1988. 275, 14588-14595. 
  12. Sutherland G.R., Richards R.I. Simple tandem DNA repeats and human genetic disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. 92, 3636-3641. 
  13. Tautz D., Schlotterer C. Simple sequences. Curr. Opin. Genet. Dev. 1994. 6, 832-837. 
  14. Bacolla A., Collins J.R., Gold B., Chuzhanova N., Yi M., Stephens R.M., Stefanov S., Olsh A., Jakupciak J.P., Dean M., Lempicki R.A., Cooper D.N., Wells R.D. Long homopurine-homopyrimidine sequences are characteristic of genes expressed in brain and the pseudoautosomal region. Nucleic Acids Res. 2006. 34, 2663-2675. 
  15. Lewis D.A., Hashimoto T., Volk D.W. Cortical inhibitory neurons and schizophrenia. Nature Rev. Neurosci. 2005. 6, 312-324. 
  16. Napierała M., Bacolla A., Wells R.D. Increased negative superhelical density in vivo enhances the genetics instability of triplet repeat sequences. J. Biol. Chem. 2005. 280, 37366-37376. 
  17. Wojciechowska M., Napierała M., Larson .I.E., Wells R.D. Non-B DNA structure formed by long DNA repeats of DM1, DM2, and PRDA genes, not the sequences per se, promote mutagenesis in flanking DNA. J. Biol. Chem. 2006. 281, 24531-24543. 
  18. Moxon R., Bayliss C., Hood D. Bacterial Contingency Loci: the role of simple sequence DNA repeats in bacterial adaptation. Annu. Rev, Genet. 2006. 40, 307-333. 
  19. http://five30liveservice.wordpress.com/2012/10/02/does-our-dna-decide/


Tagi: lab, laboratorium, mikrosatelitarne sekwencje DNA, struktury DNA, forma B-DNA, niestabilność genetyczna, mutacje, rola biologiczna
Drukuj PDF
wstecz Podziel się ze znajomymi

Recenzje



znajdz nas na fcb
Informacje dnia: Potwierdzono - składniki diety mogą powodować migreny Biomarkery prognostyczne postępów cukrzycy Białe wino może zwiększać ryzyko czerniaka Dawne antybiotyki we współczesnej terapii Garść orzechów chroni przed wieloma chorobami Czynnościowa rola białek Potwierdzono - składniki diety mogą powodować migreny Biomarkery prognostyczne postępów cukrzycy Białe wino może zwiększać ryzyko czerniaka Dawne antybiotyki we współczesnej terapii Garść orzechów chroni przed wieloma chorobami Czynnościowa rola białek Potwierdzono - składniki diety mogą powodować migreny Biomarkery prognostyczne postępów cukrzycy Białe wino może zwiększać ryzyko czerniaka Dawne antybiotyki we współczesnej terapii Garść orzechów chroni przed wieloma chorobami Czynnościowa rola białek

Partnerzy

GoldenLine Fundacja Kobiety Nauki Warszawskie Stowarzyszenie Biotechnologiczne (WSB) „Symbioza” Obywatele Nauki NeuroSkoki Biomantis Uni Gdansk MULTITRAIN I MULTITRAIN II Nauki przyrodnicze KOŁO INZYNIERÓW PB ICHF PAN FUNDACJA JWP NEURONAUKA BIOOPEN 2016 QDAY Mlodym Okiem Nauka w Polsce CITTRU - Centrum Innowacji, Transferu Technologii i Rozwoju Uniwersytetu Akademia PAN Chemia i Biznes Farmacom Świat Chemii Forum Akademickie Biotechnologia     Geodezja „Pomiędzy naukami – zjazd fizyków i chemików” WIMC WARSZAWA 2016 Konferencja Biomedyczna Projektor Jagielloński Instytut Lotnictwa EuroLab