1. Wstęp.

Wiedza o zwierzętach laboratoryjnych, jako samodzielna dyscyplina, wyodrębniona została dopiero po II wojnie światowej. Przez pewien okres pojęcie „zwierzę laboratoryjne” miało to samo znaczenie co „zwierzę doświadczalne”, które jednak może oznaczać każde żywe stworzenie poddawane obserwacji albo wykorzystywane do doświadczeń. Zalicza się do nich zwierzęta ze środowiska naturalnego jak i gospodarskie. Jednak wyniki badań przeprowadzonych na tego rodzaju zwierzętach wykazują dużą zmienności brak powtarzalności, co obniża znacznie wartość badań [7]. Dlatego też zaistniała potrzeba stworzenia modeli, jednorodnych pod względem genetycznym i posiadających cechy umożliwiające wykorzystanie ich do różnego typu badań biologicznych. Zwierze takie powinno być izolowane od czynników środowiska zewnętrznego a także utrzymywane w ściśle jednolitych warunkach [12].

a) ZWIERZĘ DOŚWIADCZALNE – zwierzę przeznaczone do wykorzystania lub wykorzystywane do doświadczeń [21].

b) ZWIERZĘ LABORATORYJNE – zwierzęta doświadczalne hodowane w obiektach jednostek hodowlanych lub doświadczalnych, w szczególności: myszy, szczury, świnki morskie, chomiki złote (syryjskie), króliki, psy, koty, przepiórki oraz zwierzęta naczelne [21].

2. Rozwój ustawodawstwa o ochronie zwierząt
a) 1924 – pierwsze ustawy  Anglia
b) 1928 – Polska – rozporządzenie Prezydenta Rzeczpospolitej, uzupełnione w roku 1959 – rozporządzeniem Ministra Szkolnictwa Wyższego – 12 artykułów, w których zakazuje się znęcania nad zwierzętami a równocześnie zezwala na dokonywanie doświadczeń na zwierzętach
c) 1978 – USA
d) 1997 – Polska – Ustawa o Ochronie Zwierząt
e) 2005 – Polska – Ustawa o doświadczeniach na  zwierzętach

3. Regulacje prawne obowiązujące w Polsce od 1997
a) Ustawa o Ochronie zwierząt z dnia 21 sierpnia 1997 oraz Ustawa z dnia 21 stycznia 2005 m.in.
-określa zasady dopuszczania zwierząt kręgowych do badań i celów dydaktycznych
-tworzy Krajową oraz Lokalne Komisje Etyczne                  
b)  Rozporządzenie Rady Ministrów z dnia 21 kwietnia 1999 w sprawie KKE oraz LKE
-KKE – przedstawiciele nauk biologicznych, medycznych, weterynaryjnych i humanistycznych (12 osób), przedstawiciele organizacji pozarządowych, których celem jest ochrona zwierząt (3 osoby).

4.  Gatunki zwierząt laboratoryjnych [21, 3].

a) Mysz: badania: farmakologiczne, toksykologiczne, immunologiczne, genetyczne, radiologiczne, transplantologiczne, nad nowotworami, standaryzacja szczepionek.
b) Szczur pierwszy raz w XIX w: badania : toksykologiczne, żywieniowe, onkologiczne, fizjologiczne, farmakologiczne, hematologiczne, transplantologiczne.
c) Świnka morska: badania: serologiczne, toksykologiczne, immunologiczne, farmakologiczne.
d) Chomik: badania: parazytologiczne, wirusologiczne, stomatologiczne, onkologiczne, immunologiczne.
e) Kot: badania: neurofizjologiczne, onkologiczne, farmakologiczne, modele chorób człowieka – zespól klinefeltera (XXY), wnętrostwo ( nie wstąpienie jader do moszny), głuchota, postępowy zanik siatkówki, mukopolisacharydoza.
f) Pies: badania: chirurgiczne, farmakologiczne, fizjologiczne, toksykologiczne, transplantologiczne, żywieniowe. Pies Haraka  - wyhodowany przez czeskiego lekarza Beagla – rasa typowa do badań laboratoryjnych.
g) Królik: badania: genetyczne, onkologiczne, immunologiczne, fizjologiczne, chirurgiczne, bakteriologiczne, transplantologia – 1895r w Anglii transplantacja zarodków.
h) Przepiórka japońska: badania: genetyczne, embriologiczne.
Przydatność zwierząt do badań naukowych to: szybkie  tempo uzyskiwania materiału do badań, proste wymagania hodowlane prosta karma.

5.  Dane o rozrodzie zwierząt laboratoryjnych [13].

 

Gatunek	Dojrzałość pł. (t.)	Długość cyklu (d.)	Długość ciąży (d.)	Liczba młodych	Laktacja (d.)
MYSZ	4 – 6	4 – 5	19 – 22	6 – 12	19 – 28
SZCZUR	6 – 8	4  -6	21 – 23	6 – 12	28
ŚWINKA	4 – 8	16	60 – 68	2 – 6	14 – 28
CHOMIK	6 – 8	4 – 5	15 – 18	4 – 8	28
KRÓLIK	12 – 16	6 – 7	28 – 32	4 – 10	28
KOT	6 – 7 M.	14	55 – 70	1 – 8	21 – 49
PIES	7 – 12M.	6M.	58 - 68	1 - 8	30

 

6. Dane o rozwoju młodych [13].

	Mysz	Szczur	Chomik	Świnka	Królik	Kot	Pies
Porastanie sierścią (dni)	3 – 12	4 – 16	5 – 8	Życie pł.	2 – 6	Życie pł.	Życie pł.
Otwieranie oczu (dni)	13–14	13-16	15-16	Życie pł.	9 – 10	7 – 10	10-16
Otwieranie przewodów sł. (dni)	2 - 3	2 – 3	4 – 5	Życie pł.	X	X	10-15
Pierwsze zęby (dni)	8 – 14	8 – 16	Życie Pł.	Życie pł.	ok. 5	14-16	20-30
Opuszczanie gniazda (dni)	od 14	od 13	od 15	od ur.	od 18	od 20	od 20

7.  Ocena stanu zdrowia [2]:

-Ektopasożyty 1x w roku
-Endopasożyty 1x w roku
-Wirusy 1x w roku
-Bakterie i grzyby 2x w roku
-Techniki symptomatologiczne oceny stanu zdrowia zwierząt laboratoryjnych:
•    Obserwacje zachowania
•    Monitorowanie przyrostów masy ciała
•    Obserwacje stanu skóry, wydalin i wydzielin

Jednym z warunków zmniejszenia liczby zwierząt potrzebnych do właściwego wykonania doświadczenia jest używanie zwierząt o znanym standardzie zdrowotnym. Ma to istotny wpływ na jakość i powtarzalność otrzymywanych wyników. Dlatego też już w latach pięćdziesiątych pod patronatem organizacji międzynarodowych (WHO, FAO, ILAR, ICLAS) wprowadzono podział zwierząt na różne kategorie zdrowotne i opracowano wykazy mikroorganizmów, które powinny być wyeliminowane u zwierząt danej kategorii i gatunku. Również w Polsce podjęto próby standaryzacji zdrowotnej zwierząt używanych do doświadczeń. Jedną z nich było wydane w 1977 r. przez Krajową Spółdzielnię Hodowli Drobnego Inwentarza zobowiązanie prywatnych hodowców do okresowego badania hodowanych zwierząt w kierunku wykrycia bakterii z grup Salmonella, Shigella, Pasteurella pneumotropica, Mycobacterium tuberculosis oraz grzybów i świerzbowców. Z inicjatywy Sekcji ds. Zwierząt Laboratoryjnych SITR - NOT we współpracy z Instytutem Zootechniki w Balicach wydano „Karty Informacyjne do Założeń Technologicznych Produkcji Zwierzęcej: Zwierzęta Laboratoryjne. W kontroli wirusologicznej obecnie stosuje się najczęściej metody serologiczne takie jak test ELISA,  test immunofluorescencji (IFA) i test zahamowania hemaglutynacji (HI)  oraz metody biochemiczne i molekularne przy identyfikacji wirusa LDV (Lactic Dehydrogenase Elevating Virus)[2].. W kontroli bakteriologicznej najczęściej stosuje się posiewy z wybranych narządów na  podłoża namnażające a następnie identyfikację drobnoustrojów przy pomocy odpowiednich zestawów np. API SYSTEM.  W niektórych przypadkach stosuje się również metodę PCR (np. do identyfikacji Helicobacter sp.,  Mycoplasma sp.), test ELISA (Mycoplasma sp., Clostridium piliformis) oraz w pewnych przypadkach np. przy wystąpieniu charakterystycznych zmian w wątrobie w chorobie Tyzzera, wywoływanej przez Clostridium piliformis,  badanie histopatologiczne.   W kontroli parazytologicznej najczęściej stosuje się metody mikroskopowe a w niektórych przypadkach test ELISA i PCR. Zwierzęta sprzedawane przez ośrodki hodowlane powinny mieć zawsze certyfikat zdrowia uwzględniający zakres i częstość prowadzonej kontroli [1].

8. Uśmiercanie zwierząt laboratoryjnych [ 13, 11].

a) KRYTERIA WYBORU METOD EUTANAZJI:

-    Minimalizacja bólu
-    Błyskawiczne działanie
-  Ograniczenie do minimum stresu i zdenerwowania (nie można usypiać zwierząt w obecności innych – przekazywanie informacji w kale i moczu)
-    Wiek, gatunek, stan zdrowia
-    Metoda powinna być łatwa do wykonania, skuteczna, powtarzalna, nieodwracalna, estetyczna, bezpieczna dla eksperymentatora

b) DOPUSZCZALNE METODY EUTANAZJI[13, 14]:

FIZYCZNE:

-    Zastrzelenie
-    Ogłuszenie
-    Porażenie prądem (zmiennym, elektrody na grzbiecie + okolice pyska lub odbytu)
-    Dyslokacja kręgów szyjnych
-    Dekapitacja – odcięcie głowy ostrym przedmiotem
-    Maceracja – ścięcie białka w różnych środowiskach
-    Promieniowaniem mikrolfalowym

CHEMICZNE: substancje które w małych dawkach służą do usypiania

-    Środki wziewne: CO2, CO, halotan, izosulfan
-   Preparaty do iniekcji: barbiturany: pentabarbituran sodu – podawany do żylnie lub do otrzewnowo; ksylazyna + ketamina

c) NIEDOPUSZCZALNE METODY EUTANAZJI:

-    Dekompresja / próżnia
-    Hipo- / hipertermia
-    Topienie / usuwanie z wody
-    Skręcanie szyi
-    Uduszenie
-    Eter, chloroform, gaz cyjanowodorowy
-    Środki nasenne
-    Narkotyczne środki przeciwbólowe

9. Doświadczenia na zwierzętach a postęp w medycynie:

50 % nagród Nobla w dziedzinie medycyny to za badania z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych (szczepionki, hormony syntetyzowane in vitro, środki do znieczulenia miejscowego, witaminy, antybiotyki, leki antymalaryczne, chemioterapia białaczki i raka, leki przeciw schizofrenii, uspokajające i antydepresyjne, prostaglandyny, leki immunosupresyjne, obecnie - doświadczenia nad lekami przeciw nowotworom i AIDS, wykrycie antygenów – droga do przeszczepów [4,6,9]. Warto wspomnieć też o przemysłowej hodowli komórek zwierzęcych, która  obecnie stosowana jest  do wytwarzania i testowania: jako źródło komórek pierwotnych do hodowli komórek i narządów , szczepionek wirusowych, interferonów, surowic odpornościowych przeciwciał monoklinalnych,  hormonów, do badań nad transplantacją tkanek i narządów, do kontroli jakości, toksyczności i mutagenności oraz o  laboratoryjnej  hodowli komórek zwierzęcych wykorzystywanych do: badań nad nowotworzeniem, diagnostyki wirusów, innych badań podstawowych w biologii [5,8].

10. Mysie modele ludzkich nowotworów [4, 20].

1. USA – Komitet zatwierdzający mysie modele do badania ludzkich nowotworów
2. Kryteria zatwierdzania mysich modeli:
•    przydatność danego modelu do badania określonego nowotworu,
•    biologia (genom) modelu,
•    cechy modelu odpowiadające nowotworowi ludzkiemu
3. Nowotwory:
•    gruczołu mlecznego ludzi – około 100 mysich modeli
•    prostaty – kilka
•    szyjki macicy – jeden
•    układu krwiotwórczego – myszy AKR

11. Szczepy wsobne.
Szczep wsobny to grupa zwierząt reprezentujących jeden gatunek, charakteryzują się jednorodnością genotypową i homozygotycznością. Uzyskuje się go metodą kojarzenia zwierząt w bliskim pokrewieństwie (brat x siostra) przez 20 lub więcej pokoleń [19].

MYSZY [18]:
a) AKR – genotyp aaBBcc – szczep wysokobiałaczkowy 90% samic i 65% samców
b) BALB/c – genotyp AAbbcc – występują nowotwory jajników, płuc, nadnerczy; wrażliwe na napromieniowanie, wykazują wysokie ciśnienie i szczególną wrażliwość na choroby górnych dróg oddechowych
c) CFW – genotyp aacc – duża różnorodność nowotworów
d) C3H – genotyp AABBCC – u wieloródek i samic dziewiczych nowotwory sutka u 90%; samce wrażliwe na chloroform, reagują martwiczymi zmianami w kanalikach krętych jąder

SZCZURÓW[18]
e) WISTAR – genotyp BBccPPhh – badania żywieniowe, toksykologiczne, psychologia zwierząt
f) SHR – aaBBcchh – wyselekcjonowany w kierunku wysokiego ciśnienia krwi
g) WKY – aaBBccHH – wyselekcjonowany w kierunku niskiego ciśnienia krwi

12.  Warunki, jakie powinny panować w zwierzętarniach [14,12, 10]:

a) Oświetlenie
-Optymalne natężenie – 60 luksów (natężenie 1 000-2 000 luksów wywołuje ślepotę u zwierząt)
-Odległość od źródeł światła – szczególnie istotna u  zwierząt albinotycznych
-Ciemność – szyszynka pobudzona do produkcji enzymu HIOMT – synteza melatoniny – hamowanie wydzielania z podwzgórza LHRH – hamowanie działania przysadki mózgowej

b) Temperatura – 20 – 22stopni C (strefa obojętności cieplnej – charakterystyczna dla gatunku – oddawanie i wytwarzanie ciepła optymalne)

c) Wilgotność – optymalna dla zwierząt laboratoryjnych wynosi około 55±5% wilgotności względnej (powiązanie z temperaturą)

d) Ciśnienie – czynnik bardzo trudny do standaryzacji, regulowany systemami wentylacyjno-klimatyzacyjnymi

e) Skład powietrza – właściwy skład powietrza osiąga się przez określoną liczbę wymian powietrza na godzinę  (pomieszczenie o kubaturze 60 m3 – 10 - 20 wymian w ciągu godziny, powietrze filtrowane przez zespół 3 filtrów)

f) Dobowy rytm aktywności
 

Fot. Katarzyna Sowa-Lewandowska
 

Fot. Katarzyna Sowa-Lewandowska
 

Fot. Agnieszka Pasternak


13. Kontrola genetyczna zwierząt laboratoryjnych

a) Podstawowymi wymaganiami, których spełnienie jest niezbędne aby wyniki badań z użyciem zwierząt laboratoryjnych były wiarygodne i powtarzalne są stałe, optymalne dla gatunku warunki środowiskowe, odpowiedni stan higieniczny zwierząt oraz ich jakość i jednorodność genetyczna. Dotychczas wyhodowano wiele szczepów wsobnych, stad niekrewniaczych oraz różnych specjalnych modeli zwierząt charakteryzujących się unikatowym zestawem cech uwarunkowanych genetycznie stanowiących o ich przydatności do określonego typu doświadczeń i testów. Wybór właściwych zwierząt jest jednym z podstawowych czynników warunkujących uzyskanie wartościowych i powtarzalnych wyników badań. Niezależne hodowle szczepów zwierząt w różnych ośrodkach naukowych doprowadziły do powstania szeregu podszczepów, które mimo stwierdzonych różnic genetycznych zachowały nazwy szczepów wyjściowych uzupełnione symbolem podszczepu [9]. Mimo ścisłego przestrzegania zasad hodowli zawsze należy liczyć się z możliwością powstania i utrwalenia się mutacji. Osobnym zagadnieniem jest sprawa kontaminacji genetycznej, której najczęstszymi przyczynami są: zła organizacja pracy w zwierzętarni, braki w wyszkoleniu personelu, złe „nawyki” hodowlane, niewłaściwe prowadzenie dokumentacji oraz brak dozoru i kontroli. Wynikiem ewentualnych zmian genetycznych w najlepszym razie może być zauważalna przez hodowcę zmiana cech fenotypowych takich jak np. kolor sierści. Jednak zmiana większości genetycznie uwarunkowanych cech biologicznych często wykrywana jest dopiero w trakcie doświadczenia, gdy wpływa na jego przebieg i w sposób istotny na jakość otrzymanych wyników. W celu wczesnego wykrywania ewentualnych zmian genetycznych w populacji hodowanych zwierząt w wielu ośrodkach, również krajowych, w latach osiemdziesiątych zaczęto wprowadzać programy monitorowania genetycznego zwierząt dostosowane do potrzeb, zadań i możliwości ośrodka [3,4]. W praktyce genetyczne monitorowanie polega na kontroli utrzymania autentyczności hodowanych szczepów. W zależności od stosowanych metod oznaczania oraz funkcji oznaczonych markerów podzielono je na kilka podstawowych grup: markery immunologiczne, biochemiczne, cytogenetyczne, morfologiczne oraz stosowane ostatnio coraz częściej markery DNA (mikrosatelitarne).

b) Monitorowanie genetyczne na podstawie wybranych markerów cech jakościowych.
W monitorowaniu genetycznym zwierząt laboratoryjnych najczęściej stosowane są antygeny zgodności tkankowej, kodowane przez geny głównego kompleksu zgodności tkankowej MHC oraz antygeny różnicowania limfocytów np.: Thy1. Wykorzystanie genów głównego kompleksu zgodności tkankowej do kontroli jakości i jednorodności szczepów znalazło szerokie zastosowanie z uwagi na: wysoki stopień polimorfizmu, rola, jaką odgrywają w badaniach immunologicznych, konieczność monitorowania szczepów szczególnie cennych z racji genotypu MHC (szczepy kongenicznie oporne), skuteczność i łatwość wykrywania kontaminacji. Do oznaczania genów MHC stosuje się metody transplantacyje, metody serologiczne i metody komórkowe. W metodzie transplantacyjnej  najczęściej wykorzystywane są  przeszczepy skóry. Test ten pozwala na identyfikację różnic genetycznych w obrębie kompleksu genów zgodności tkankowej oraz na kontrolę jednorodności genetycznej szczepu.  Problemy dotyczące metodyki i interpretacji wyników zostały opisane już w 1951 r. przez Billinghama i Medawara [1]. Metoda jest czuła i skuteczna, ujemną jej stroną jest konieczność ponad 100 dniowej obserwacji badanych zwierząt. W około 10 – 15% przypadków odrzucenie przeszczepu spowodowane jest przyczynami technicznymi lub zakażeniem bakteryjnym. Niekorzystną stroną metody transplantacyjnej jest jednak przede wszystkim to, że musi być wykonana in vivo, a zatem powinna być stosowana jedynie w wyjątkowych przypadkach. Test hemaglutynacji i reakcja cytotoksyczna zależna od komplementu są podstawowymi metodami serologicznymi, w których zastosowanie odpowiednich przeciwciał pozwala na identyfikację antygenów zgodności tkankowej charakteryzujących poszczególne haplotypy MHC [5].  Test cytotoksyczny może służyć zarówno do identyfikacji antygenów MHC jak i do określania antygenów różnicowania limfocytów: Ly, Lyb, TL, Thy1.Spośród licznych wariantów tego testu najczęściej stosuje się zaproponowany przez Pincusa i Gordona [16] test mikrocytotoksyczny na płytkach Terasaki przy użyciu limfocytów z węzłów chłonnych jako komórek docelowych i świeżej surowicy królika jako źródła komplementu [1].

c) Markery biochemiczne. Markerem biochemicznym jest uwarunkowana genetycznie cecha fenotypowa, którą można określić za pomocą technik biochemicznych. W praktyce markerami biochemicznymi są izoenzymy i białka nieenzymatyczne kodowane przez polimorficzne, strukturalne geny. Mnogość oznaczanych markerów biochemicznych i występowanie kodujących je genów na różnych chromosomach przesądzają o ich istotnym znaczeniu dla potrzeb kontroli genetycznej. Każdy szczep wsobny ma ustalony genetyczny profil markerów biochemicznych, który pozwala odróżnić go od innych szczepów i podszczepów. Szczegółowy opis metod stosowanych do oznaczania markerów biochemicznych zawarty został w podręczniku „Zwierzęta Laboratoryjne – Metody Hodowli i Doświadczeń” [16]. Wśród najczęściej stosowanych markerów biochemicznych wymienić można: dehydrogenazę jabłczanową – Mod1(mysz),  łańcuch hemoglobiny – Hbb (mysz), białko pęcherzyków nasiennych – Sup1 (szczur), esterazę – 1 – Es-1 (szczur)[17].

d) Markery cytogenetyczne. Rozwój cytogenetyki umożliwił wprowadzenie monitorowania genetycznego zwierząt na podstawie analizy ich kariotypu. Zaobserwowano, że zabarwione w odpowiedni sposób chromosomy wykazują specyficzny dla siebie i charakterystyczny dla gatunku układ poprzecznych prążków wzdłuż ramion chromosomów umożliwiający identyfikację par chromosomów i ułożenie kariotypu komórki. Analizując kariotypy zwierząt ze szczepów wsobnych wykazano szereg morfologicznych cech chromosomów dotyczących miedzy innymi  kształtu, intensywności zabarwienia i wielkości prążków C widocznych po zabarwieniu heterochromatyny okolicy centromeru. Stwierdzono wyraźne różnice w morfologii prążków C pomiędzy poszczególnymi parami chromosomów kariotypu danego gatunku. Cechą charakterystyczną dla wszystkich myszy jest brak prążka C w chromosomie Y. U myszy istnieją również różnice rozkładu heterochromatyny centromerycznej charakterystyczne dla poszczególnych szczepów. Obserwacje te pozwalają na rozróżnianie myszy z niektórych szczepów wsobnych za pomącą badania prążków. Również markery chromosomowe powstałe w wyniku translokacji mogą służyć do identyfikacji szczepu. Ich brak lub heterozygotyczność mogą świadczyć o kontaminacji np. myszy szczepu AKR Rb (6, 15) posiadające marker powstały w wyniku fuzji centromerycznej chromosomów 6 i 15 łatwo odróżnić badaniem cytogenetycznym od myszy ze szczepu AKR wyjściowego bez tego markera. Jednakże wykorzystanie markerów cytogenetycznych do monitorowania genetycznego zwierząt z racji czasochłonności, trudności technicznych i wysokich wymagań dotyczących kwalifikacji personelu możliwe jest tylko w specjalistycznych laboratoriach do typowania szczególnych przypadków [20, 8].

e) Markery morfologiczne – geny umaszczenia. Do tej grupy markerów należy wiele cech uwarunkowanych ekspresją jednego genu dotyczących umaszczenia, charakteru okrywy włosowej, nieprawidłowości w budowie szkieletu, które w większości przypadków mogą być rozpoznawane i testowane bez użycia specjalistycznego wyposażenia. Najczęściej w praktyce stosuje się kontrolę genów umaszczenia. Kontrolę taką u myszy albinotycznych przeprowadza się stosując krzyżówki ze zwierzętami ze szczepów barwnych o znanym recesywnym genotypie. W przypadku myszy najczęściej używany jest szczep DBA/2 o genotypie aabbCCdd (a – nie agouti, b – obecnie Tyrp1b – brązowy, C – obecnie Tyr – nie albinotyczny, d – obecnie Myo5ad – rozcieńczony). Na podstawie oceny umaszczenia mieszańców F1 wnioskuje się o genotypie zwierzęcia z badanego szczepu. Ponadto na podstawie umaszczenia myszy w pokoleniu F1 można wnioskować o czystości genetycznej szczepów użytych do krzyżowania. Wszystkie zwierzęta pierwszego pokolenia mieszańców powinny być jednakowo umaszczone. Wystąpienie segregacji świadczy o kontaminacji szczepu[15].

f) Markery mikrosatelitarne w kontroli genetycznej zwierząt szczepowych. Postepowanie, podobnie jak w przypadku innych markerów, polega przede wszystkim na stworzeniu profili genetycznych dla poszczególnych, podlegających kontroli szczepów wsobnych. Markery mikrosatelitarne precyzyjnie zmapowane i równomiernie rozproszone w genomie są stosunkowo proste do analizowania.W badaniach stosuje się najczęściej technikę nieizotopowego PCR i ocenę długości amplifikowanych alleli na żelu agarozowym o wysokiej rozdzielczości. Przy wyborze markerów należy brać pod uwagę następujące kryteria:  położenie na różnych chromosomach. odpowiedni poziom polimorfizmu, obecność unikalnych alleli charakteryzujących poszczególne szczepy, łatwość rozdziału otrzymywanych fragmentów na żelu agarozowym o wysokiej rozdzielczości prawidłowo przebiegającą reakcję PCR. Przy zastosowaniu metody analizy markerów mikrosatelitarnych można przy niewielkim nakładzie kosztów i w raczej krótkim czasie przeprowadzać okresową kontrolę genetyczną hodowanych zwierząt przez porównywanie uzyskiwanych wyników z uprzednio opracowanymi profilami. Metoda ta, w Polsce nowa, stosowana jest już w wielu ośrodkach światowych zarówno w celu kontroli genetycznej zwierząt, jak też do badania ich genomu i do doświadczeń z wykorzystaniem analizy sprzężeń [7].

g) Kontrola genetyczna stad niekrewniaczych.
Najtrudniejszym zadaniem w hodowli stad niekrewniaczych jest utrzymanie zmienności genetycznej zwierząt na możliwie stałym poziomie przez wiele pokoleń. Systemy kojarzeń i liczebność stad muszą być tak dobrane aby współczynnik wsobności (inbredu) był niższy niż 1% na pokolenie. W populacjach mniejszych niż 100 par niezbędne jest stosowanie wybranych metod kojarzeń rotacyjnych lub tak zwanej metody maksymalnego unikania kojarzeń krewniaczych. W celu zachowania stałego spektrum genetycznego populacji niekrewniaczych w 1981 r. Rapp i wsp. [6 z Centralnego Instytutu Hodowli Zwierząt w Hanowerze wprowadzili metodę tak zwanej liniowej optymalizacji w doborze zwierząt do kojarzeń. Przy zastosowaniu tej metody niezbędna jest jednak charakterystyka wielu wybranych cech ilościowych i jakościowych hodowanych zwierząt, ustalenie normy populacji i charakterystycznej frekwencji klas wartości. Metoda liniowej optymalizacji jest  bardzo pracochłonna i kosztowna. W hodowlach, gdzie nie jest możliwe wprowadzenie metody liniowej optymalizacji, można uzyskać ograniczenie i utrzymanie na możliwie jednakowym poziomie zmienności stada prowadząc znaną z genetyki populacyjnej selekcję stabilizującą. Przy jej zastosowaniu do dalszej hodowli wybieramy tylko te osobniki, u których wartości badanych cech mają najniższe odchylenie od normy populacji. Jak już na wstępie powiedziano w hodowli stad niekrewniaczych niezbędne jest ustalenie normy populacji oraz stosowanie jednego ze znanych systemów kojarzeń rotacyjnych lub metody hodowli z tak zwany mmaksymalnym unikaniem inbredu (kojarzeń krewniaczych) [17].

14. Wykaz instytucji zajmujących się hodowlą zwierząt laboratoryjnych w Polsce [http://www.nauka.gov.pl].

Amk – Akademia Medyczna, 00-325 Warszawa, ul. Krakowskie Przedmieście 26/28; Pracownia Zwierząt Laboratoryjnych, dr Janina Kwiatkowska, tel.: 826 73 42
Amp – Akademia Medyczna, 60-631 Poznań, ul. Dojazd 30; Katedra i Zakład Toksykologii, dr Czesław Sadowski, tel.: 847 20 81
Brw – Katedra Genetyki i Ogólnej Hodowli Zwierząt SGGW, 02-786 Warszawa, ul. Ciszewskiego 8, prof. Elżbieta Wirth – Dzięciołowska, tel.: 853 09 31
Cmd – Instytut – Centrum Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej PAN, Warszawa, ul. Pawińskiego 5, mgr inż. Anna Kowalczyk, tel.: 608 64 47  
Ibd – Instytut Biologii Doświadczalnej PAN, Warszawa, ul. Pasteura 5, lek wet. Krzysztof Grącki, tel.: 668 32 36
Ibs – Uniwersytet Jagielloński, Instytut Biologii Środowiskowej, 30-060 Kraków, ul. Ingardena 6, prof.  Marchlewska – Koj, tel.: 633 03 18
Ifz – Instytut Fizjologii i Żywienia Zwierząt PAN, Jabłonna, ul. Instytucka 3; Zwierzętarnia, mgr Anna Ochtabińska
 Igh – Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN, Jastrzębiec, 05-552 Wólka Kosowska, tel.: 756 17 11
Iiw – Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej i Klinicznej PAN, 52-114 Wrocław, ul. R. Weigla 12; Ośrodek Hodowli Zwierząt Wsobnych, mgr inż. Marta Mraz – Dulemba, tel.: 373 22 74 w 294
Imp – Instytut Medycyny Pracy, 90-950 Łódź, ul.  Teresy 8; Dział Zwierząt Laboratoryjnych, mgr Joanna Piasecka – Zelga, tel.: 631 4653
Jlg – Przedsiebiorstwo Farmaceutyczne „Jelfa” S.A., 58-500 Jelenia Góra, ul.W.Pola 21; Dział Kontroli Jakości przy Laboratorium Farmakologicznym
Kr – Uniwersytecki Szpital Dziecięcy, 30-663 Kraków, ul. Wielicka 265; Zakład Immunologii Klinicznej, Zwierzętarnia, dr Danuta Stankiewicz, tel: 658 20 11 w 1380
Krf – Uniwersytet Jagielloński, Wydział Farmaceutyczny, 30-060 Kraków, ul.Medyczna 9; Zwierzętarnia, mgr Anna Obruśnik, tel.: 657 02 62
Kw – Uniwersytet Jagielloński, Zakład Genetyki i Ewolucjonizmu, 30-060 Kraków, ul. Ingardena 6, dr hab. Józefa Styrna, tel.: 633 63 77 w 2434
Lod – Centrum Zdrowia Matki Polki, 93-338 Łódź, ul. Rzgowska 281/289; Zakład Zwierząt Laboratoryjnych, inż. Teresa Mydlikowska, tel.: 271 77 07
Piw – Państwowy Instytut Weterynaryjny, Puławy, Al. Partyzantów 57, Zakład Farmakologii i Toksykologii, dr Marta Minta, tel. 886 30 51 w 283
Pzh – Państwowy Zakład Higieny, Warszawa, ul. Chocimska 24;  Hodowla Zwierząt Doświadczalnych, mgr inż. Alina Dębińska, tel 54 21 390
Tar – Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, 02-096 Warszawa, ul. Miecznikowa 1; Zwierzętarnia, mgr inż. Katarzyna Kisiel, tel.: 554 29 06  
Uwm – Uniwersytet Warmińsko – Mazurski, 10-715 Olsztyn, ul.M.Oczapowskiego 13, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, tel. 523 32 96
W – Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Sklodowskiej – Curie, 02-781 Warszawa, ul. W.K.Roentgena 5; Zakład Genetyki i Hodowli Zwierząt Laboratoryjnych, tel.: 644 50 24 w . 2604
15. Wykaz zwierząt laboratoryjnych hodowanych w Polsce.
http://www.nauka.gov.pl/fileadmin/user_upload/Nauka/krajowa_komisja_zwierzeta/20110125_wykaz_zw_laboratoryjnych_2010.


PODSUMOWANIE.
Badania prowadzone za zwierzętach i/lub z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych  będą zawsze źródłem wielu moralnych dylematów, zarówno społeczeństwa jak i naukowców. Członkowie brytyjskiej organizacji Universities Federation of Animal Welfare, poszukując sposobów na ograniczenie cierpień zwierząt stanowiących nieodłączna część wielu badań, stworzyli zasadę 3R. Program 3R – 1959 William Russell i Rex Burch [7]:
I. REDUCTION – zmniejszenie liczby używanych do doświadczeń zwierząt  tak by przynosiły pożądane efekty przy użyciu jak najmniejszej liczby zwierząt (metody statystyczne, rachunek prawdopodobieństwa).
II. REPLACEMENT – (zastąpienie) metody alternatywne (hodowle komórek i tkanek in vitro, modelowanie zjawisk biologicznych).
III. REFINEMENT – doskonalenie metod doświadczalnych (humanitarne zakończenie badań – przerwanie doświadczeń z chwilą uzyskania odpowiednich danych).

Dla przykładu: badanie ostrej toksyczności polega na 2-tygodniowej obserwacji skutków jednorazowego podania badanej substancji (lub kilkukrotnego podania w ciągu pierwszej doby). Najszerzej akceptowanym wskaźnikiem toksyczności ostrej jest dawka letalna LD50, czyli ilość substancji zabijająca połowę badanych zwierząt. Dawniej do jej wyznaczenia trzeba było użyć 6 lub 7 grup zwierząt, po 10 samców i 10 samic. Każdej grupie podawano inną dawkę badanej substancji i po 2 tygodniach liczono padłe osobniki. Z czasem stwierdzono, że uśmiercanie tak wielu zwierząt to spora przesada. Od roku 1989 dzięki zastosowaniu odpowiednich metod statystycznych, do przeprowadzenia wiarygodnych testów wystarczyło 45 osobników, a zatwierdzona obecnie przez OECD procedura umożliwia określenie LD50 przy użyciu średnio 16. Dzięki niedawno zakończanym międzynarodowym badaniom  oraz wprowadzeniu zasady 3R liczbę te być może uda się zredukować do 6 [7].  Poszczególne państwa w rożny sposób regulują kwestie związane z testami bezpieczeństwa. W UE od roku 2003 nie wolno sprzedawać kosmetyków, których składniki lub końcowy produkt były badane na zwierzętach. Wyjątek zrobiono dla testów, których nie dało zastąpić się uznanymi testami alternatywnymi do tych z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych. Tutaj zaliczyć możemy:  modele i symulatory, film i wideo, multimedialne symulacje komputerowe, eksperymenty prowadzone przez studentów na sobie nawzajem, zwłoki zwierzęce pozyskane w sposób etyczny, praktyka kliniczna, metody in silico – komputerowe modele interakcji różnych układów do analizy aktywności leków, metody in vitro, biofotonikę.  Spośród wymienionych metod alternatywnych coraz większą popularnością cieszy się biofotonika [7]. Opiera się ona  na genetycznym zmodyfikowaniu badanych komórek – wprowadza się do nich gen kodujący lucyferazę (enzym odpowiedzialny za świecenie świetlików), dzięki któremu one i ich potomstwo świecą. Tak zmienione komórki, np. nowotworowe, wprowadza się do organizmu, a specjalistyczna aparatura rejestrująca fotony pozwala śledzić proces ich namnażania się pod wpływem różnych środków chemicznych lub farmaceutyków i to na długo, zanim rozwinie się wyczuwalny guz. Taka procedura eliminuje ból i cierpienie i można ją wykorzystywać do badania początkowych stadiów wielu różnych chorób. 

Jeżeli natomiast chodzi o ocenę bezpieczeństwa substancji stosowanych w rolnictwie, to zarówno EPA (agencja ochrony środowiska), jak i jej europejskie odpowiedniki szczegółowo określają zestaw wymaganych testów. Np. zbadanie pestycydu zajmuje co najmniej dwa lata i wymaga użycia około 10 tys. zwierząt kilku gatunków. Naukowcy najpierw sprawdzają czy dana substancja przenika przez skórę, czy może być wchłonięta droga oddechową, a także czy w jakiejś postaci pozostaje na roślinach lub w plonach, grożąc przedostaniem się do przewodu pokarmowego. Dla każdej z tych sytuacji oceniają czas ekspozycji na badaną substancję, szacują przypuszczalnie wchłoniętą ilość i jej rozmieszczenie w narządach i tkankach. Testy przeprowadza się na osobnikach w różnym wieku, także na płodach.


Opracowała: Katarzyna Sowa-Lewandowska

Literatura.

1. Billingham R.E., Madawar P.B.: The technique of free skin grafting in mammals. J.Exper.Biol., 1951, 28, 385-402
2. Brylińska J.: Zastosowanie wskaźników reprodukcyjnych i morfometrycznych do kontroli zmienności genetycznej myszy i szczurów ze stad niekrewniaczych. Zwierzęta Lab., 1985, 22(1-2), 3-7
3. Czarnomska A., Kuśnierczyk P., Strządała L., Sitarz M., Woszczyński M., Krysiak E., Zborowska E., Leszczyńska – Czech J., Zioło E., Pajtasz E., Rak J., Kwaśniewska E., Mraz – Dulemba M., Radzikowski Cz.: Genetic monitoring of inbred strains and congenic lines of mice maintained at six scientific centres in Poland. Zwierzęta Lab., 1987, 24(1-2), 29-38
4. Czarnomska A., Sitarz M., Zborowska E.: Kontrola genetyczna myszy laboratoryjnych. II.Analiza wybranych markerów morfologicznych i immunologicznych u myszy z 23 szczepów wsobnych. Zwierzęta Lab., 1983, 20(1-2), 55-66
5. Demant P.: Histocompatibility genes and their use in genetic control of laboratory mice. In: A.Spiegiel, S.Erichsen, H.A. Solleveld (eds.), Animal quality and models in biomedical research. 7th ICLAS Symposium, Utrecht 1979, Stuttgart – New York: Gustav Fischer Verlag, 299-306
6. Festing M.F.W., Lovell D.P.: Routine genetic monitoring of commercial and other mouse colonies in UK using mandible shape; five years of experience. In: A.Spiegiel, S.Erichsen, H.A. Solleveld (eds.), Animal quality and models in biomedical research. 7th ICLAS Symposium, Utrecht 1979, Stuttgart – New York: Gustav Fischer Verlag, 341-348
7. Gajewska M., Łukasiewicz D., Rutkowski R., Wirth – Dzięciołowska E: Markery mikrosatelitarne w rutynowym monitorowaniu genetycznym myszy szczepów wsobnych. Doniesienie zjazdowe „Zwierzęta laboratoryjne w nowym tysiącleciu”, 2002, streszczenia str. 18
8. Hedrich J.H.: Principles in genetic monitoring. In H.J.Hedrich (ed.), Genetic monitoring of inbred strains of rats. Stuttgart - New York: Gustav Fischer Verlag,, 1990,  8-10
9.Hsu C-K.: Genetic monitoring. In J.G.Fox, B.J.Cohen, F.M.Loew (eds.), Laboratory animal medicine. New York: Academic Press Inc., 1984, 603-612
10. M.Kruczek. 1998. Male chemical signals and female choice in the bank vole Clethrionomys glareolus. Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego. Rozprawy habilitacyjne 334, pp.52
11. J.Kapusta.1998. Gonadal hormones and intrasexual aggressive behavior in female bank voles    (Clethrionomys glareolus). Aggress. Behav. 24: 63-70.
12. M.Kruczek. 2000. Recognition of kin in bank voles (Clethrionomys glareolus). Physiol. Behav 90, 483-489.
13. M.Kruczek, M.Zatorska. 2008. Male rank affects reproductive success and offspring performance in bank voles. Physiol. Behav 94, 611-615.
14. J.Kapusta, G.D.Sales, R.Czuchnowski. 2007. Aggression and vocalization behaviour of three sympatric vole species during conspecific and heterospecific same-sex encounters. Behaviour 144: 283-305.
15. Pietrowicz D., Lindner P., Wojda K.: Analysis of the usefulness of certain craniometric features in genetic identification of laboratory rats. Z.Versuchstierkd., 1982, 24, 257-261
16.  Pincus J.H., Gordon R.C.: A microassay for the detection of murine H-2 antigens. Transplantation, 1972, 12, 509-513
17. Rapp K.G., Burow K., Kluge R.: Monitoring of outbred populations. Zwierzęta Lab., 1981, 18, 2, 25-33
18.Sitarz M., Woszczyński M., Czarnomska A.: Charakterystyka wsobnych szczepów myszy pod względem markerów biochemicznych Mod-1, Gpd-1, Idh-1, Pgm-1, Gpi-1s. Zwierzęta Lab., 1990, 27, 1, 45-52
19. Woszczyński M, Krysiak E., Czarnomska A.: Opracowanie i wdrożenie programu rutynowego monitorowania genetycznego szczepów wsobnych myszy na podstawie wybranych grup markerów różnicujących. Zwierzęta Lab., 1990, 27, 2, 9-16
20.Woszczyński M., Sitarz M., Czarnomska A.: Wstępne wyniki kontroli genetycznej szczurów AUG/W, L-E/W, M520/W, SPRD/W, WAG/W, BN/W. Zwierzęta Lab., 1990, 27, 2, 17-26
21.   Zwierzęta Laboratoryjne – Metody Hodowli i Doświadczeń. J.Brylińska, J.Kwiatkowska (red.) Rozdział 6: Kontrola genetyczna. Universitas, 1996, 81-103   

Linki:
http://www.nauka.gov.pl
http://www.nauka.gov.pl/fileadmin/user_upload/Nauka/krajowa_komisja_zwierzeta/20110125_wykaz_zw_laboratoryjnych_2010

Drukuj PDF