Kod genetyczny przechowywany w DNA jest odpowiedzialny za wszystkie cechy, począwszy od koloru oczu a skończywszy na podatności na zachorowania. Zmusiło to naukowców do przeprowadzenia sekwencjonowania genomu ludzkiego oraz opracowania sposobów zmiany kodu genetycznego, niemniej jednak wiele spośród chorób pozostaje nierozłączna z różnego rodzaju cząsteczkami podstawowymi RNA.

Podobnie jak w przypadku pośredniczącego materiału genetycznego, który przenosi kod genetyczny od jądra komórkowego, naukowcy dość długo starali się opracować efektywną metodę celowania w RNA żywych komórek. Badacze z Akademii Medycznej w San Diego przy Uniwersytecie Kalifornijskim uzyskali żądane wyniki na drodze zastosowania popularnej techniki edycji DNA CRISPR-Cas9 względem RNA.



Na zdjęciu przedstawiono komórkę przenoszącą systemCas9 wycelowany w RNA, który ukazuje rozkład beta aktynów mRNA w cytoplazmie.


"O ile nam wiadomo, jest to pierwsza próba wycelowania w RNA w żywych komórkach z wykorzystaniem CRISPR-Cas9," stwierdził główny autor publikacji dr Gene Yeo, adiunkt wydziału medycyny komórkowej i molekularnej. "Nasze bieżące prace skupiają się na śledzeniu ruchu RNA wewnątrz komórki, jednak w przyszłości możliwe będzie dokonywanie pomiarów innych właściwości RNA lub ulepszanie podejścia terapeutycznego w celu wprowadzania korekty zachowań RNA wywołujących schorzenia."

Lokalizacja RNA w komórce - a także sposób oraz czas jego przedostawania się do jej wnętrza – może wywierać wpływ na właściwą lokalizację oraz stosowny czas wytwarzania białek. Na przykład, białka ważne dla połączeń neuronowych w mózgu, zwane synapsami, wytwarzane są z RNA zlokalizowanych na tych połączeniach. Transport wadliwych RNA jest nierozłączny z różnorodnymi uwarunkowaniami od autyzmu aż po nowotwory. Naukowcy próbują opracować sposoby na prowadzenie pomiarów wielkości przesunięcia RNA w celu stworzenia metod leczenia opisanych uwarunkowań.

Próby edycji oraz pomiaru DNA – w charakterze narzędzia wpływającego na zmianę wielkości produkcji białka, opracowanie podstawowych funkcji biologicznych oraz korygowanie wad podczas leczenia schorzeń – w ciągu ostatnich kilku lat uległy przyspieszeniu. Właśnie wtedy badacze odkryli, że istnieje możliwość pobrania CRISPR-Cas9, naturalnie występującego mechanizmu obronnego, który bakterie wykorzystują do odpierania ataków innych bakterii, a następnie jego zastosowania do edycji genów u ssaków.

Zazwyczaj CRISPR-Cas9 działa w następujący sposób: badacze projektują "przewodnik" RNA do łączenia sekwencji określonego namierzonego genu. RNA zostaje wycelowane w enzym Cas9 w żądanym punkcie genomu, w którym dochodzi do przecięcia łańcucha DNA. Komórka w sposób niesprecyzowany powoduje naprawienie pęknięcia w łańcuchu DNA, tym samym prowadząc do dezaktywacji genu albo badacze dokonują wymiany przekroju przylegającego do cięcia wraz z właściwą wersją genu.

Aż do chwili obecnej, CRISPR-Cas9 można było wykorzystywać wyłącznie do manipulacji DNA. Yeo oraz jego współpracownicy z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Berkeley zastosowali niniejszą technikę do opracowania elastycznych środków do wycelowania RNA w żywych komórkach, zwaną również Cas9 wycelowany w RNA (RCas9).

Aby dokonać wycelowania w kierunku RNA zamiast DNA badacze dokonali zamiany kilkunastu cech układu CRISPR-Cas9. Bazując na podstawie wcześniejszych studiów opracowanych przez dr Jennifer Doudna z UC Berkeley zaprojektowano krótki kwas nukleinowy zwany PAMmer, który wraz z przewodnikiem RNA, kieruje Cas9 na cząsteczkę RNA.

Aby dokonać próby układu, zespół Yeo dokonał wycelowania RNA, które szyfruje białka ACTB, TFRC oraz CCNA2. W dalszej kolejności obserwowano Cas9, połączone z białkiem fluorescencyjnym, a także odkryto ruch RNA w kierunku granuli stresu, czyli grupy białek oraz RNA, które tworzą się w cytozolu komórki (obszar poza jądrem), w warunkach, gdy komórka poddawana jest obciążeniom. Granule stresu pozostają nierozłączne z chorobami neurodegeneracyjnymi, na przykład stwardnienie zanikowe boczne (ALS). Niniejszy układ umożliwia śledzenie RNA w jednostce czasu, w żywych komórkach bez potrzeby zastosowania sztucznych znaczników zwyczajowo stosowanych w innych technikach śledzenia RNA – technika, która ingeruje w typowe procesy komórkowe.


Źródło: http://www.nanowerk.com/news2/biotech/newsid=42896.php

Drukuj PDF