Akceptuję
W ramach naszej witryny stosujemy pliki cookies w celu świadczenia państwu usług na najwyższym poziomie, w tym w sposób dostosowany do indywidualnych potrzeb. Korzystanie z witryny bez zmiany ustawień dotyczących cookies oznacza, że będą one zamieszczone w Państwa urządzeniu końcowym. Możecie Państwo dokonać w każdym czasie zmiany ustawień dotyczących cookies. Więcej szczegółów w naszej Polityce Prywatności

Zamknij X
Reklama1
Strona główna Artykuły

Chromatografia powinowactwa: zastosowanie do izolowania i oczyszczania substancji biologicznie aktywnych

Chromatografia powinowactwa jest typem chromatografii adsorpcyjnej, w której wykorzystuje się wzajemne powinowactwo dwóch substancji. Ze względu na swoje właściwości, metoda ta pozwala znacznie uprościć procedurę izolowania wybranej substancji, przy jednoczesnym zachowaniu jej biologicznej aktywności. Jako metoda szybka i skuteczna, chromatografia powinowactwa znalazła bardzo szerokie zastosowanie, jednak jak każda z metod posiada zarówno wady jak i zalety stosowania [2].
 
Zalety metody chromatografii powinowactwa:
- metoda ta nie jest obciążona ograniczeniem w stosunku do objętości nanoszonej na kolumnę próbki
-w metodzie tej istnieje możliwość silnego zatężania izolowanej próbki, a ponadto chromatografia ta charakte ryzuje się bardzo wysoką specyficznością
- ponadto istnieje możliwość uzyskania czystej postaci molekuły, które bardzo często nie mogą być izolowane z wykorzystaniem innch metod
- wyizolowany materiał charakteryzuje się bardzo wysokim stopniem czystości i to
pomimo zastosowania tylko jednego kroku preparatywnego w całej procedurze [2].

Wady chromatografii powinowactwa:

- trudności z uzyskaniem niektórych specyficznych ligandów
- częsta konieczność przygotowania złoża we własnym zakresie
- niska trwałość niektórych ligandów [2].

Cząsteczkę immunoglobuliny G budują 2 łańcuchy ciężkie oraz 2 łańcuchy lekkie, zaś integralność całej cząsteczki zapewniona jest przez obecnośc w jej budazzowie mostków disulfidowych, które to łączą ze sobą skłądowe cząsteczki tej immunoglobuliny. Pod względem budowy przeciwciała IgG przypominają literę Y- gdzie ramiona tej litery zbudowane są z łańcuchów lekkich, a także fragmentów łańcuchów ciężkich. Miejsce wiążące antygen znajduje się na końcach ramion cząsteczki. Ponadto, łańcuchy ciężkie połączone są ze sobą dwoma mostkami disulfoidowymi w regionie zawiasowej ruchomości ramion cząsteczki.

Łańcuchy lekkie (L) zbudowane są z około 220 aminokwasów, zaś łańcuchy ciężkie (H) z ok. 440 aminokwasów. Fragmenty z z końca N łańcucha ciężkiego i leżące w pobliżu łańcucha lekkiego tworzą wspólnie miejsce wiązania antygenu. Cząsteczka IgG zawiera dwa miejsca wiązania antygenu, co w konsekwencji czynią ją dwuwartościową. Ta dwuwartościowość pozwala na wiązanie przez cząsteczkę dwóch cząsteczek antygenu [4].



Zdjęcie:  Struktura cząsteczki przeciwciała , [4].

W przypadku, gdy cząsteczka IgG zostanie strawiona jakimś enzymem (np. papainą lub pepsyną), dochodzi do podziału cząsteczki na fragmenty.
Pepsyna odcina fragmenty ciężkich łańcuchów poniżej pierwszego wiązania disulfidowego w regionie zawiasowym. W wyniku tego dochodzi do powstania dwuwalencyjnego fragmentu (Fab’)2, który złożony jest z ramion IgG połączonych mostkiem disulfidowym, a także fragment Fc, który zawiera pozostałości łańcuchów ciężkich. W przypadku hydrolizy przeciwciałą papiną, wiązania disulfidowe pozostają w obrębie fragmentu Fc, zaś ramiona cząsteczki IgG występują osobno jako jednowalencyjne fragmenty Fab [3].


Papaina (proteaza) tnie IgG uwalniając z jej cząsteczki (o kształcie litery Y) dwa fragmenty tworzące ramiona. Każdy z tych fragmentów zawiera pojedyncze  miejsce wiążące antygen, przez co nazywane jest fragmentem Fab (ang. fragment antigen bnding).  Z racji tego, że fragmenty Fab zawierają pojedyncze miejsce wiązania antygenu nie mają zdolności wiązania antygenów poprzecznie (są jednowartościowe).  Uwolniony w wyniku cięcia trzon cząsteczki mający kształt litery Y, zbudowany z odcinków łańcuchów ciężkich, które położone są na końcu C, określany jest fragmentem Fc (ang. cristallization), ponieważ łatwo ulega on krystalizacji [4].

Do szybkiego oczyszczania fragmentów Fab oraz (Fab’)2 z fragmentów Fc można wykorzystać złoże z kowalencyjnie związanym białkiem A. W trakcie przepływu mieszaniny białek przez kolumnę, białko A selektywnie wychwytuje fragmenty Fc oraz niestrawione cząsteczki IgG. W wypływającym z kolumny materiale znajdują się fragmenty Fab lub (Fab’)2 zależne od uzytwgo enzymu. Po elucji ze złoża materiału związanego z białkiem A, fragmenty Fc można oczyścić z całych cząsteczek IgG stosując w tym celu filtrację żelową (pozwala na to znaczna różnica między masami cząsteczkowymi tych białek : IgG= 160 kDa, a Fc= 50 kDa) [3].

Izolowanie fragmentów Fab i Fc immunoglobulin z wykorzystaniem białka A (G. Stingl i wsp., 1977)


Wykonanie:
Złoże Protein A Sepharose CL-4B w objętości 2 ml należy umieścić w plastikowej kolumnie, po czym przemyć je 10 ml buforu fosforanowego (0,2 M bufor fosforanowy o pH= 7,5). Próbkę hydrolizatu IgG (10 ml) powstałą po trawieniu papainą należy rozcieńczyć buforem fosforanowym do stężenia białka nie przekraczającego 1 mg/ml.  Próbkę hydrolizatu przepuścić przez kolumnę i zbierać wypływający z kolumny materiał w postaci 1 ml frakcji [6].
W trakcie przepływu próbki przez kolumnę zachodzi adsorpcja fragmnetów Fc i niestrawionych cząsteczek IgG na białku A, zaś fragmenty Fab wypływają z kolumny bez oddziaływań. Kolumnę przemyć 10 ml buforu fosforanowego ,następnie 10 ml  buforu fosforanoweg  z dodatkiem NaCl (0,2 M bufor fosforanowy -1 M NaCl pH=7,5), a na sam koniec 10 ml samego buforu fosforanowego.  Specyficznie związane białka należy wyeluować za pomocą buforu cytrynianowego (0,1 M bufor cytrynianowy o pH= 3,5) i zbierać frakcje w objętości 1 ml , po czym oznaczyć je spektrofotometrycznie przy λ=280 nm.  Frakcje, które zawierają fragmenty Fc należy poddać dializie wobec buforu fosforanowego o pH= 7,5. P rozdziale chromatograficznym złoże należy przemyć 40 ml wody, a dalej 10 ml 20% etanolu. Tak przygotowane złoże można przechowywać w 4oC [3], [6].
Na podstawie rozdziału elektroforetycznego można ocenić czystość oraz jakośc wyizolowanych fragmentów Fab i Fc ( rozdział w 7,5% żelu poliakryloamidowym z dodatkiem SDS). Podczas rozdziału, fragmenty Fab powinny wędrować  w żelu jako bialka o masie cząsteczkowej 55 kDa i 25 kDa- odpowiednio przed i po redukcji ,ostków disulfidowych. Fragmenty Fc w tych samych warunkach rozdziału powinny wędrowac jako białka o m.cz. 50 kDa i ok. 25 kDa [3], [6].

Zastosowanie konkanawaliny A (Con A)do frakcjonowania glikoprotein i glikolipidów osocza krwi (V.G. Shore)


Konkanawalina A oddziałuje z resztami cukrowymi i ma powinowactwo do glukozy, oddziałuje z resztami cukrowymi, dzięki czemu reakcję tą wykorzystuje się powszechnie do frakcjonowania cząsteczek białkowych oraz lipoproteinowych , które to zawierają boczne łańcuchy wielocukrowe. W zależności od liczby oraz umiejscowienia reszt cukrowych, zawierające je cząsteczki różnią się pod względem powinowactwa oddziaływania z unieruchomioną na nośniku konkanawaliną [7].


Wykonanie:
Jako materiał do badań należy użyć mrożonego osocza człowieka lub świni.
5 ml rozmrożonego osocza należy rozcieńczyć do objętości 50 ml za pomocą buforu A(tj.: 0,1 M bufor fosforanowy, 0,5 M NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 o pH= 7,5). Następnie, korzystając z wyjściowych roztworów glukozy i mannozy (o znanym stężeniu), należy przygotować ich rozcieńczenia w objętości 10 ml każde,  tj: 0,1 M; 0,2 M; 0,3 M oraz 0,4 M ( do rozcieńczeń użyć buforu A). Złoże Con A Sepharose 4B w obj. 10 ml upakować w kolumnie, po czym przemyć je 100 ml buforu A. Dalej, na kolumnę nanieść rozcieńczoną próbkę osocza, a następnie kolumnę ponownie przemyć 100 ml buforu A [3], [7].
Białka należy najpierw eluować za pomocą roztworu glukozy, przepuszczając przez złoże po 10 ml wcześniej przygotowanych roztworów  w porządku narastającego stężenia glukozy (0,5 M roztwór glukozy w buforze A itd.). Z roztworami mannozy postąpić w identyczny sposób. Na końcowym etapie rozdziału, przez kolumnę przepuścić 50 ml  buforu boranowego o pH=6.0. W trakcie całej elucji należy zbierać 2 ml frakcje i oznaczać je spektrofotometrycznie w celu oznaczenia stężenia białka [7].
Po zakończonym rozdziale kolumnę przemyć 100 ml buforu A, oraz 20 ml buforu A z dodatkiem NaN3 (0,01% roztwór NaN3 w buforze A). Przemyta kolumna może być przechowywana w 4oC. 


W celu polepszenia wyników rozdziału chromatograficznego poszczególnych frakcji, w celu elucji białek można zastosować gradient liniowy stężenia glukozy i mannozy, zamiast ich gradientu skokowego [3], [7].
Plazminogen (Plg) jest białkiem wytwarzanym przez wątrobę . Ponadto , jest on wydzielany do osocza w postaci nieaktywnego prekursora proteazy serynowej tj.  plazminy. Plazminogen jest syntetyzowany jako polipeptyd o długości 810 aminokwasow, zaś po odcięciu tzw.  sekwencji liderowej, natywne białko składa się z 791 aminokwasów [1].
Ludzki plazminogen należy do  glikoprotein. Wiązanie plazminogenu na powierzchni komórek patogenów, które atakują ustrój człowieka, a także jego aktywacja do plazminy jest jednym z mechanizmów inwazyjności. To właśnie taki sposób ułatwia migrację drobnoustrojów, a także  wpływa na kolonizację tkanek zaatakowanego organizmu [1].
Enolaza jest białkiem wiążącym plazminogen na powierzchni komórek prokariota. Jej obecność opisano po raz pierwszy w grupie A streptokokow – Streptococcus pyogenes [1].
Enolaza wyeksponowana na powierzchni komórek może stanowić receptor dla pewnych ligandów. Szczególnie interesująca jest  receptorowa rola enolazy wobec plazminogenu ludzkiego. System enolaza-plazminogen (plazmina) jest jednym z mechanizmów ułatwiających inwazyjność patogenów w ustroju człowieka. Ponadto,  pełni istotną rolę w procesie miogenezy, a także w rozroście tkanek nowotworowych. Obecność enolazy na powierzchni komórek patogenów atakujących ustrój człowieka jest też źródłem generowania przeciwciał, co stanowi podłoże rozwoju rożnych chorób autoimmunologicznych [1].

Izolowanie plazminogenu z zastosowaniem złoża zawierającego lizynę (D.G. Deutsch, 1970)


Plazminogen jest selektywnie adsorbowany z osocza przez lizynę, która to związana jest kowalencyjnie ze złożem Sepharose 4B.  Gdy odmyjemy nieswoiście związane białka osocza, proenzym ten można wyeluować z żelu Lysine Sepharose 4B używając 0,2 M roztworu kwasu ε-aminokapronowego (kwas 6-aminoheksanowy) [8].
W złożu Lysine Sepharose 4B, L-lizyna połączona jest za pośrednictwem grupy α-aminowej, pozostawiając zarówno grupę α-aminową jak i grupy α-karboksylowe wolne, dzięki czemu mogą one swobodnie współpracować z substancjami próbki podczas chromatografii.  Żel Lysine Sepharose 4B przeznaczony jest do oczyszczania cząsteczek biospecyficznych [9].


Wykonanie:
10 ml żelu Lysine Sepharose 4B należy przemyć 2x za pomocą  0,1 M buforu fosforanowego o pH= 7,4 (należy wykorzystać ok. 30 ml buforu). Przemyty żel upakować w plastikowej kolumnie. Rozmrożone 20 ml osocza uzupełnić do 200 ml 0,1 M buforem fosforanowym, po czym przepuścić przez przygotowaną wcześniej kolumnę. Nieswoiście zaadsorbowane białka należy odmyć  z kolumny  używając w tym celu 0,3 M bufor fosforanowy o pH=7,4 (50 ml). Związany swoiście z lizyną plazminogen wymyć 0,2 M roztworem kwasu ε-aminokapronowego  (30 ml), po czym zbierać wypływający z kolumny materiał w 2 ml frakcjach.
Po zebraniu frakcji, kolumnę kolejno przemyć:
- 30 ml  0,1 M buforu fosforanowego
- oraz 30 ml 0,01 % roztworu NaN3 w 0,1 M buforze fosforanowym o pH= 7,4. Po przemyciu kolumnę przechowywać w temperaturze 4oC.
Frakcje, w których znajduje się plazminogen zidentyfikować spektrofotometrycznie przy λ= 280 nm, usunąć z nich kwas ε-aminokapronowy, stosując w tym celu dializę wobec 0,05 M buforu fosforanowego o pH= 7,4. (lub filtrację żelową na kolumnie wypełnionej złożem Sephadex G-25). Całą preparatykę prowadzić w temperaturze 4oC [3], [8].

Oczyszczanie mRNA z zastosowaniem złoża zawierającego poli(U) (J.M. Taylor)


Poli(U) Sepharose 4B może być użyta do izolacji poli(A). Złoże to jest adsorbentem, który specyficznie a także w odwracalny sposób wiąże kwasy nukleinowe pochodzenia roślinnego oraz mRNA.  Złoże to przygotowuje się przez związanie długich łańcuchów kwasu poliurydylowego  (tj. ok. 100 podjednostek) z żelem Sepharose 4B.
Prawie wszystkie cząsteczki mRNA mają w swojej strukturze sekwencję kwasu poliadenylowego [poli(A)], która to jest komplementarna do sekwencji poli(U). Dzięki wykorzystaniu komplementarności obydwu zasad, możliwe jest łatwe wyizolowanie cząsteczek mRNA w drodze chromatografii powinowactwa [3], [5].

Materiał:

Jako materiał do badań należy użyć odwodniony preparat całkowitego RNA.

Wykonanie:
W wodzie destylowanej rozpuścić DEPC (0,1% dietylopirowęglan). Całość poddać działaniu DEPC przez 12 godzin, a następnie wyautoklawować. Wszystkie bufory użyte w doświadczeniu muszą zostać przygotowane na wodzie z DEPC [10].
Odważyć 1 g żelu Poly(U)-Sepharose 4B , nanieśc na szklany filt, po czym przemyć 0,1 M roztworem NaCl (100 ml). Tak przygotowane złoże  (ok. 5-10 ml) upakować w szklanej kolumnie, którą wcześniej należy wyautoklawować.  Tak upakowaną kolumnę przemyć 100 ml buforu startowego (tj. 25% roztwór formamidu w układzie: 50 mM Tris-HCl, 0,7 M NaCl, 10 mM EDTA o pH= 7,5).  Ok. 1-3 g próbki RNA rozpuścić w buforze ekstrakcyjnym (tj. 50 mM Tris-HCl, 1% N-lauroilosarkozyna, 30 mM EDTA o pH= 7,5), całośc podgrzać do temperatury 65oC i utrzymywać w tej temp. przez około 5 min., a następnie szybko schłodzić na lodzie i rozcieńczyć 5-krotnie za pomocą buforu startowego [10].


Przygotowaną w  ten sposób próbkę przepuścić przez kolumnę z żelem Poly(U)-Sepharose 4B. Kolumnę przemyć 100 ml buforu startowego w celu usunięcia niespecyficznie zaadsorbowanych cząsteczek [10].


Cząsteczki mRNA (umocowane za pomocą wiązań wodorowych), można wymyć za pomocą buforu do elucji (ok. 20 ml), który zawiera dużą ilość, b aż 90% formamidu, i zbierać 1  ml frakcje (eluaty). Zebrane eluaty oznacza się spektrofotometrycznie przy λ=254 nm. Jako próbę referencyjna należy zastosować bufor do elucji.  Na koniec, kolumnę ponownie przemyć 100 ml buforu do elucji, a dalej buforem startowy (100 ml). Tak przygotowaną kolumnę można przechowywać w temperaturze 4oC do 4 tygodni [3], [10].


Autor: Lidia Koperwas

Literatura:
[1]. Sewery E., Pietkiewicz J.,  Szamborska A, Gamian A., 2007. Enolase on the surface of prockaryotic and eukaryotic cells is a receptor for human plasminogen. Postepy Hig Med Dosw. (online), 2007; 61: 672-682
[2]. http://www.biofizyka.p.lodz.pl/ch8.pdf
[3]. Kłyszejko-Stefanowicz L, 2003. Ćwiczenia z biochemii. Wydawnictwo Naukowe PWN, 2003, s. 158- 163
[4]. Hames D.B., Hooper N.M., 2009. Biochemia-krótkie wykłady. Wydawnictwo Naukowe PWN, s. 117-118
[5]. http://www.gene.mie-u.ac.jp/Protocol/M&M/Poly%28U%29%20sepharose.html
[6]. Stingl G., Wolff-Schreiner E.C., Pichler W.J., Gschuait F., Knapp W., Wolff K., 1977. Epidermal Langerhans cells bear Fc and C3 receptors. Nature, 268: 245-246
[7].Shore V.G., Shore B., 1973. Heterogenity of human plasma very low density lipoproteins. Separation of species differing in protein components. Biochemistry, 12 : 502- 507.
[8]. Deutsch D.G., Mertz E.T., 1970. Plazminogen: Purification from human plasma by affinity chromatography. Science, 170 : 1095- 1096.
[9].https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1314729545976/litdoc71709500AE_20110830205431.pdf
[10]. Taylor J.M., Tse T.P.H., 1976. Isolation of rat liver albumin messenger RNA. J. Biol. Chem. 251: 7461- 7467.




Tagi: chromatografia powinowactwa, przeciwciała, immunoglobuliny, IgG, Fc, Fab, łańcuch, pepsyna, papaina, izolacja, białko A, konkanawalina A, frakcjonowanie glikoprotein, glikolipidy, lab, osocze krwi, plazminogen
Drukuj PDF
wstecz Podziel się ze znajomymi

Recenzje



znajdz nas na fcb
Informacje dnia: Stypendia naukowe dla wybitnych młodych naukowców Nanomateriały pomagają w oczyszczaniu wody Pływanie zmniejsza ryzyko zgonu Męska płodność na poziomie molekularnym 16 mln euro dla naukowców zajmujących się żywnością Innowacyjne cewniki medyczne Stypendia naukowe dla wybitnych młodych naukowców Nanomateriały pomagają w oczyszczaniu wody Pływanie zmniejsza ryzyko zgonu Męska płodność na poziomie molekularnym 16 mln euro dla naukowców zajmujących się żywnością Innowacyjne cewniki medyczne Stypendia naukowe dla wybitnych młodych naukowców Nanomateriały pomagają w oczyszczaniu wody Pływanie zmniejsza ryzyko zgonu Męska płodność na poziomie molekularnym 16 mln euro dla naukowców zajmujących się żywnością Innowacyjne cewniki medyczne

Partnerzy

GoldenLine Fundacja Kobiety Nauki Warszawskie Stowarzyszenie Biotechnologiczne (WSB) „Symbioza” Obywatele Nauki NeuroSkoki Biomantis Uni Gdansk MULTITRAIN I MULTITRAIN II Nauki przyrodnicze KOŁO INZYNIERÓW PB ICHF PAN FUNDACJA JWP NEURONAUKA BIOOPEN 2016 QDAY Mlodym Okiem Nauka w Polsce CITTRU - Centrum Innowacji, Transferu Technologii i Rozwoju Uniwersytetu Akademia PAN Chemia i Biznes Farmacom Świat Chemii Forum Akademickie Biotechnologia     Geodezja „Pomiędzy naukami – zjazd fizyków i chemików” WIMC WARSZAWA 2016 Konferencja Biomedyczna Projektor Jagielloński Instytut Lotnictwa EuroLab