Laboratoria.net
|
Zamknij X
|
W metodach wykorzystywanych do określania stopnia krzepliwości fibrynogenu związek ten występując w roztworze ulega przekształceniu we włóknik. Proces zachodzi pod wpływem działania enzymu trombiny, a stosunek ilości wykrzepionego włóknika do białka całkowitego występującego w preparacie (wyrażony w procentach) stanowi tzw. stopień krzepliwości fibrynogenu [1].
Zewnątrzpochodny szlak krzepnięcia krwi
W zachodzącej w organizmie klasycznej kaskadzie krzepnięcia krwi, trombina może zostać aktywowana na drodze dwóch szlaków tj. szlaku zewnątrzpochodnego i wewnątrzpochodnego. Wspólnym celem dla obydwu dróg inicjacji krzepnięcia są osoczowe czynniki X i IX. W dalszych etapach procesu krzepnięcia, w obu przypadkach dochodzi również do aktywacji trombiny. Na wewnątrzpochodny tor krzepnięcia krwi składają się tzw. czynniki kontaktu, czyli białka do których zaliczane są osoczowe czynniki XI, XII, prekalikreinę osoczową oraz wielkocząsteczkowy kininogen(jednołańcuchowa glikoproteina) [8].
Krzepnięcie krwi in vivo
Proces ten zapoczątkowywany jest przez tromboplastynę tkankową (TF), która eksponowana jest na powierzchni komórek (zwłaszcza tych aktywowanych lub uszkodzonych komórek śródbłonka). TF zaliczana jest do glikoprotein śródbłonkowych, a w swojej budowie posiada miejsca wiążące fosfolipidy. Co więcej, białko to nie jest wykrywane w nieuszkodzonych komórkach śródbłonka, ale występuje w błonie komórkowej wielu innych typów komórek, które w normalnych warunkach nie mają kontaktu z krwią. W przypadku, gdy TF jest eksponowana na powierzchni aktywowanych lub uszkodzonych komórek śródbłonka lub gdy dochodzi do kontaktu krwi z komórkami tkanek pozanaczyniowych eksponujących TF na powierzchni, dochodzi do połączenia się TF z czynnikiem VII. Następnie utworzony kompleks TF-VIIa na powierzchni pobudzonych komórek śródbłonka powoduje aktywację czynników IX i X do IXa i Xa. Kompleks TF-VIIa i czynnik Xa na drodze sprzężenia zwrotnego dodatniego aktywuje jeszcze więcej czynnika VIIa. Z dostarczanych w trakcie badań danych wynika, że głównym zadaniem zewnątrzpochodnego szlaku krzepnięcia in vivo jest szybkie dostarczenie śladowych ilości trombiny, która następnie aktywuje czynniki XI, VIII i V. Ponadto związek ten powoduje agregację płytek krwi, łącznie wpływając na przyspieszanie procesu krzepnięcia krwi szlakiem wewnątrzpochodnym [9].
Oznaczanie stopnia krzepliwości fibrynogenu
Fibrynogen w roztworze przekształcany jest we włóknik pod wpływem działania trombiny. Ilość wykrzepionego włóknika do białka całkowitego znajdującego się w badanym preparacie stanowi o stopniu krzepliwości fibrynogenu. Parametr ten oznaczany jest w procentach [1].
Wykonanie:
Do probówki w łaźni wodnej (w temp. 37°C) należy dodać 1 ml roztworu fibrynogenu (o stężeniu 0,1 -1%) wraz z dodatkiem 1 ml roztworu trombiny wołowej (8 j.NIH/ml w soli fizjologicznej). Tak przygotowany roztwór należy pozostawić na 1-godzinną inkubację,a następnie utworzony w próbce włóknik nawinąć na szklaną bagietkę i odcisnąć na ściance probówki. Otrzymany skrzep przenieść na kawałek jedwabiu ułożonym na kilku warstwach bibuły filtracyjnej (o wymiarach 10x10 cm). Włóknik przemyć 3x za pomocą roztworu soli fizjologicznej (czynność tę wykonywać bardzo ostrożnie, najlepiej przemywając produkt za pomocą szklanej bagietki). Przemyty włóknik przenieść do probówki zawierającej 10 ml 40% roztworu mocznika w 0,2 M NaOH. Próbkę pozostawić na ok. 60 minut do całkowitego rozpuszczenia, a następnie roztwór zmierzyć spektrofotometrycznie przy długości fali równej λ= 280 nm (pomiar absorbancji w 1-centymetrowej warstwie roztworu wobec próby kontrolnej). Na podstawie otrzymanych wyników obliczyć stężenie wykrzepionego włóknika (współczynnik absorbancji Fg A 1%280= 15,5) oraz stopień krzepliwości fibrynogenu wg poniższego wzoru:
Stopień krzepliwości = stężenie fibrynogenu (mg/ml)x 10 ml / stężenie fibrynogenu (mg/ml) x 100% [1].
Uwaga: wysoki stopień krzepliwości fibrynogenu wskazuje na dużą czystość preparatu [1].
Pod wpływem działania trombiny i jonów wapnia fibrynogen znajdujący się w osoczu cytrynianowym ulega przekształceniu we włóknik stabilizowany lub niestabilizowany działaniem samej trombiny. By w próbce doszło do aktywacji czynnika XIII wymagana jest obecność obydwu czynników.
By sprawdzić zachowanie się włóknika w roztworach stabilizowanych i niestabilizowanych w niektórych roztworach można przeprowadzić poniższe doświadczenie.
Wykonanie:
Do przygotowanych w 2 szeregach 4 probówek znajdujących się w łaźni wodnej o temp. 37°C należy dodać:
- do pierwszego szeregu 1 ml 25 mM roztworu CaCl2 (tj. 0,368 g CaCl2∙2H2O rozpuścić w pewnej ilości wody, a następnie uzupełnić do końcowej objętości równej 100 ml).
- do drugiego szeregu wprowadzić 1 ml 25 mM roztworu EDTA (tj. 0,93 g C10H14N2O8Na2∙2H2O rozpuścić w pewnej ilości wody, po czym uzupełnić do 100 ml).
Do wszystkich przygotowanych na statywach probówek należy wprowadzić po 1 ml osocza cytrynianowego wraz z 0,5 ml roztworu trombiny wołowej (20 j.NIH/ml w soli fizjologicznej). Zawartość probówek dokładnie wymieszać i inkubować przez 30 minut. Wytrącone w trakcie inkubacji skrzepy należy nawinąć na szklaną bagietkę i odcisnąć na ściance probówki (otrzymane supernatanty usunąć), a włóknik przenieść ponownie do probówek.
Następnie do 2 pierwszych probówek z szeregu I i II odmierzyć po 5 ml roztworu mocznika (tj. 6 M roztwór mocznika otrzymany przez rozpuszczenie 36 g mocznika w ok. 90 ml wody i uzupełnienie próbki do objętości 100 ml). Do kolejnych dwóch probówek w szeregach dodać po 5 ml CH2ClCOOH (1% roztwór), do kolejnych probówek po 5 ml 0,9% roztworu NaCl, a do ostatnich 2 probówek odmierzyć po 5 ml H2O.
Otrzymane w powyższy sposób mieszaniny należy dokładnie wstrząsnąć (wszystkie probówki) i obserwować zachodzące zmiany tj. niestabilizowany włóknik powinien ulec rozpuszczeniu w 2 pierwszych roztworach (probówka 1 i 2 z tego samego szeregu), zaś włóknik stabilizowany nie ulegnie rozpuszczeniu w żadnym z przygotowanych układów [1].
25 maja 2018 roku zacznie obowiązywać Rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) 2016/679 z dnia 27 kwietnia 2016 r (RODO). Potrzebujemy Twojej zgody na przetwarzanie Twoich danych osobowych przechowywanych w plikach cookies. Poniżej znajdziesz pełny zakres informacji na ten temat.
Zgadzam się na przechowywanie na urządzeniu, z którego korzystam tzw. plików cookies oraz na przetwarzanie moich danych osobowych pozostawianych w czasie korzystania przeze mnie ze strony internetowej Laboratoria.net w celach marketingowych, w tym na profilowanie i w celach analitycznych.
Administratorami Twoich danych będziemy my: Portal Laboratoria.net z siedzibą w Krakowie (Grupa INTS ul. Czerwone Maki 55/25 30-392 Kraków).
Chodzi o dane osobowe, które są zbierane w ramach korzystania przez Ciebie z naszych usług w tym zapisywanych w plikach cookies.
Przetwarzamy te dane w celach opisanych w polityce prywatności, między innymi aby:
dopasować treści stron i ich tematykę, w tym tematykę ukazujących się tam materiałów do Twoich zainteresowań,
dokonywać pomiarów, które pozwalają nam udoskonalać nasze usługi i sprawić, że będą maksymalnie odpowiadać Twoim potrzebom,
pokazywać Ci reklamy dopasowane do Twoich potrzeb i zainteresowań.
Zgodnie z obowiązującym prawem Twoje dane możemy przekazywać podmiotom przetwarzającym je na nasze zlecenie, np. agencjom marketingowym, podwykonawcom naszych usług oraz podmiotom uprawnionym do uzyskania danych na podstawie obowiązującego prawa np. sądom lub organom ścigania – oczywiście tylko gdy wystąpią z żądaniem w oparciu o stosowną podstawę prawną.
Masz między innymi prawo do żądania dostępu do danych, sprostowania, usunięcia lub ograniczenia ich przetwarzania. Możesz także wycofać zgodę na przetwarzanie danych osobowych, zgłosić sprzeciw oraz skorzystać z innych praw.
Każde przetwarzanie Twoich danych musi być oparte na właściwej, zgodnej z obowiązującymi przepisami, podstawie prawnej. Podstawą prawną przetwarzania Twoich danych w celu świadczenia usług, w tym dopasowywania ich do Twoich zainteresowań, analizowania ich i udoskonalania oraz zapewniania ich bezpieczeństwa jest niezbędność do wykonania umów o ich świadczenie (tymi umowami są zazwyczaj regulaminy lub podobne dokumenty dostępne w usługach, z których korzystasz). Taką podstawą prawną dla pomiarów statystycznych i marketingu własnego administratorów jest tzw. uzasadniony interes administratora. Przetwarzanie Twoich danych w celach marketingowych podmiotów trzecich będzie odbywać się na podstawie Twojej dobrowolnej zgody.
Dlatego też proszę zaznacz przycisk "zgadzam się" jeżeli zgadzasz się na przetwarzanie Twoich danych osobowych zbieranych w ramach korzystania przez ze mnie z portalu *Laboratoria.net, udostępnianych zarówno w wersji "desktop", jak i "mobile", w tym także zbieranych w tzw. plikach cookies. Wyrażenie zgody jest dobrowolne i możesz ją w dowolnym momencie wycofać.
Więcej w naszej POLITYCE PRYWATNOŚCI
Recenzje