Rożne odmiany chromatografii powinowactwa: chromatografia kowalencyjna i chelatująca

Chromatografia kowalencyjna

Technika ta znalazła zastosowanie w przypadku izolowania cząsteczek, które w swej budowie zawierają grupy tiolowe. U podstaw chromatografii kowalencyjnej leży możliwość kowalencyjnego wiązania między cząsteczkami, które zawierają grupy tiolowe, z wolnymi grupami tiolowymi, które znajdują się w obrębie złoża. Powstałe wiązanie jest wiązaniem odwracalnym [3].
Wiązanie większości ligandów wykorzystywanych w technice chromatografii powinowactwa przebiega z udziałem głównie dwóch grup tj. grupy aminowej i karboksylowej. Istnieje również trzeci rodzaj reszt, które także biorą udział w tych oddziaływaniach. Są to grupy –SH ( sulfhydrylowe). Matryce zawierające unieruchomione reszty sulfhydrylowe znalazły szerokie zastosowanie w odniesieniu do związków posiadających w swej strukturze wolne reszty tiolowe, co w szczególności dotyczy enzymów [3].

Przygotowanie złoża

Proces przygotowania złoża do chromatografii kowalencyjnej oraz roztworu białka powinien przebiegać w łagodnych warunkach. Najlepszym pH środowiska jest obojętne lub lekko kwaśne. W pH ~ 8 większość białek zawierających tiole reaguje dość szybko, natomiast w pH kwaśnym (ok. 4,0) dochodzi do wzrostu selektywność wiązania danego białka. Wiązać będą się tylko te białka, które posiadają grupy –SH [4].

Elucja białek

Elucja zaadsorbowanych białek odbywa się przy pomocy niskocząsteczkowych tioli . Wśród nich najczęściej używane są ditiotreitol lub 2-merkaptoetanol znajdujące się w obojętnym pH buforu elucyjnego. Po elucji, czynniki redukujące muszą być odmyte ze złoża i zastąpione resztą 2-pirydylową . W tym celu miesza się 1 objętość etanolowego roztworu dwusiarczku 2-2’- dipirydylu (30-40 mg/ml) z czterema objętościami żelu w 0,1 M buforze boranowym ( o pH 8,0), który to zawiera 1 mM EDTA [4].

Na koniec, mieszaninę ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 80°C przez 3 godziny. Złoże przemywa się etanolem i równoważy za pomocą wyjściowego buforu(do przechowywania złoża stosuje się 0,02% azydek sodu). W procesie wiązania tioli, ze złoża uwalniany jest 2-tioketon pirydyny, posiadający własności absorpcyjne (przy λ= 343nm), copozwala na śledzenie całego procesu sorpcji [4].

Izolowanie białek erytrocytarnego pasma 3, zawierających wolne grupy –SH (Kahlenberg A. , Walker C., 1976)

BPA (białka przenoszące aniony) należą do rodziny tioglikoprotein, które znajdują się w błonach erytrocytów. Są to białka pasma 3, które biorą udział w transporcie jonów przez błonę erytrocytu. Izolowanie tych białek za pomocą tradycyjnych metod izolacji jest niezwykle trudne, co dodatkowo często prowadzi do otrzymania preparatów zdenaturowanego białka. Zastosowanie do izolacji kowalencyjnej chromatografii powinowactwa pozwala na wyodrębnienie tych białek w postaci aktywnej, a co ważne w trakcie jednego etapu i w dość łatwy sposób [1].

Zdjęcie: Erytrocyt, http://www.kns.b2me.pl/art-metody-stosowane-w-pomiarach-wlasciwosci-erytrocytow,122,0.html [5].

Wykonanie:

5 ml erytrocytów (erytrocyty krwi człowieka lub świni) przemyć za pomocą soli fizjologicznej (3-krotnie), po czym dokonac lizy erytrocytów w odpowietrzonej wodzie (pozbawionej jonów). Powstałe błony erytrocytów przemyć i zawiesić w 10 ml buforu strtowego (tj. 10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA o pH= 7,5) z dodatkiem Triton X-100 (0,1%) [1], [3].

Ekstrakcję białek błonowych należy prowadzić w temperaturze pokojowej przez około 2 godziny. Po upływie czasu inkubacji, mieszaninę odwirować, a powstały podczas wirowania supernatant zebrać i przechowywać (do dalszych etapów preparatyki).
Następnie, należy przystąpić do przygotowania złoża do chromatografii. W tym celu odważyć 1 g złoża Activated-Thiol-Sepharose 4B, nanieść na szklany filtr, po czym przemyć za pomocą wody destylowanej, a następnie 200 ml odpowietrzonej wody [1], [3].

Tak przygotowany żel upakować w szklanej kolumnie oraz zrównoważyć za pomocą 50 ml buforu startowego. Przez przygotowaną kolumnę przepuścić ekstrakt białek błonowych erytrocytów, zaś po rozdziale za pomocą 50 ml buforu startowego należy usunąc z kolumny niespecyficznie zaadsorbowane cząsteczki, po czym przystąpić do wymywania kowalencyjnie związanego materiału, używając w tym celu 20 ml buforu do elucji (tj. 10 mM tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM L-cysteina (pH=8.0)) [1], [3].

Wypływający z kolumny materiał zbierać w postaci 1 ml porcji, po czym określić spektrofotometrycznie frakcje zawierające białka pasma 3. Pomiar prowadzić przy λ=280 nm.
Na koniec, kolumnę przemyć 50 ml buforu do regeneracji złoża (tj. 10 mM Tris-HCl, 1,5 mM dwusiarczek dipirydylu o pH=8.0). Po przemyciu buforem do regeneracji, kolumnę ponownie zrónoważyć 50 ml buforu startowego. Tak przygotowana kolumnę można ponownie użyć lub przechowywać 1 miesiąc w temp. 4^oC [3], [1].

Chromatografia chelatująca

U podstaw tego rodzaju chromatografii leży możliwość odwracalnego wiązania tj. chelatowania jonów metali, co odbywa się dzięki specjalnie przygotowanemu nośnikowi. W metodzie tej zazwyczaj stosuje się złoże Epoxy-activated Sepharose 6B, do którego można trwale przyłączać ligand chelatujący jony. Takim ligandem może być np. kwas iminodioctowy (IDA), bądź gotowe złoże Chelating Sepharose 6B [3].

Często stosowaną grupą chelatującą jest tris(karboksymetylo)etylenodiamina (TED), która to ma zdolność nadawania powstałemu złożu odmienne własności w porównaniu z IDA. Złoże zawierające tris(karboksymetylo)etylenodiamina (TED) wykazuje większe powinowactwo w stosunku do jonu metalu i słabsze – w stosunku do białka w porównaniu z analogicznym złożem IDA. Ponadto, złoża zawierające TED tworzą kompleksy (pojedyncze wiązanie koordynacyjne), zaś złoża z IDA tworzą chelaty (koordynacja wielopunktowa). Wśród najczęściej stosowanych metali przejściowych w chromatografii chelatującej wyróżnia się cynk oraz miedź. Znane są także przypadki zastosowania takich metali jak nikiel, kobalt czy i wapń [4].

Zdjęcie: wzór kwasu iminodioctowego, http://www.merckmillipore.com/poland/chemicals/kwas-iminodioctowy-sol-disodowa-monohydrat/MDA_CHEM-841784/p_8bab.s1LNvsAAAEWiOEfVhTl [6].

Metale przejściowe stosowane w technice chromatografii chelatującej biorą udział w wiązaniach koordynacyjnych z elektrodonorowymi resztami łańcuchów bocznych aminokwasów takich jak: histydyna, cysteina czy tryptofan, występującymi na powierzchni białek. Unieruchamianie metali na odpowiednich złożach odbywa się z udziałem grup chelatujących. Wybrany metal musi wykazywać większe powinowactwo do matrycy niż do białka, w oczyszczaniu którego ma wziąć udział [4].

Izolowanie białek surowicy wiążących jony metali (J.Porath i wsp., 1975)

Cząsteczki białkowe w różny sposób oddziałują z jonami metali. Siła oddziaływania zależy od struktury przestrzennej cząsteczki (domeny wiążące jony metali), a także od zawartości reszt aminokwasowych. Reszty aminokwasowe mogą bezpośrednio wiązać jony metali, wśród nich znajdują się takie aminokwasy jak: His, Trp i Cys. Ważnym czynnikiem jest również pH otoczenia, gdzie optimum przypada na pH w przedziale od 6 do 8. Elucję materiału specyficznie zaadsorbowanego do złoża umożliwia zabieg obniżenia pH, oraz jednoczesne zwiększenie siły jonowej stosowanego eluentu, bądź zastosowanie do elucji silnego chelatora jonów dwuwartościowych. W tym przypadku możliwe jest użycie EDTA [2], [3].

Wykonanie:
Należy pobrać 5 ml złoża Chelating Sepharose 6B, 10-15 ml złoża upakować w plastikowej kolumnie, po czym przemyć je 50 ml wody destylowanej, a dalej 50 ml 20 mM buforu fosforanowego o pH= 7.0. Przez tak przygotowaną kolumnę przepuścić 20 ml roztworu CuSO4 (tj. 1 mg/ml CuSO4 w buforze fosforanowym o pH=7.0). Ma to na celu związanie jonów miedzi ze złożem. W wyniku tego zabiegu złoże powinno zmienić barwę: z białej na niebieską. Nadmiar jonów miedzi należy usunąć przez przemycie kolumny 20 ml buforu fosforanowego [2], [3].
10 ml surowicy krwi człowieka lub świni należy rozcieńczyć 10-krotnie buforem fosforanowym, po czym przepuścić ją przez kolumnę. Niespecyficznie zaadsorbowane białka usunąć z kolumny przez ponowne przemycie jej 50 ml buforu fosforanowego [2], [3].

Białka eluować z kolumny stosując w tym celu kolejno bufory cytrynianowe o malejącej wartości pH i rosnącej sile jonowej:
- 50 ml buforu cytrynianowego o malejącej wartości pH (tj. 100 mM bufor cytrynianowy – 100 mM NaCl, pH= 6.0)
- 50 ml buforu cytrynianowego (tj. 100 mM bufor cytrynianowy – 400 mM NaCl , pH= 5.0)
- 50 ml buforu cytrynianowego (tj. 100 mM bufor cytrynianowy – 700 mM NaCl , pH= 4.0).
Jony miedzi, które są związane ze złożem, oraz silnie związane z nimi białka usunąć z kolumny za pomocą 50 ml roztworu 50 mM EDTA- 1 M NaCl. Wypływający z kolumny materiał zbierać w postaci 2 ml frakcji, po czym metodą spektrofotometryczną oznaczyć w tych frakcjach zawartość białka. Pomiar prowadzić przy λ= 280 nm [2], [3].
Po oznaczeniu, kolumnę przemyć za pomocą wody destylowanej (50 ml), po czym może byc ona ponownie używana, bądź zakonserwować ją 20% etanolem (30 ml). Tak przygotowana kolumna może być przechowywana w 4^oC [2], [3].

Izolowanie komórek z wykorzystaniem chromatografii powinowactwa

Chromatografia powinowactwa może być wykorzystana jako użyteczna technika w izolacji określonych komórek. W takim przypadku, metoda ta wymaga uwzględnienia specyficznych warunków, które są niezbędnych do zachowania stabilności izolowanych komórek.
Komórki mogą być selekcjonowane na złożach zawierających unieruchomione białko lub inny ligand, który na powierzchni komórki rozpoznawany będzie przez inne specyficzne białko lub receptor. Z uwagi na różne wielkości komórek, główny problem podczas izolacji stanowi dobór właściwej matrycy, która to pozwoli na swobodną migrację komórek przez złoże.

Tak więc, zakładając, że średnia wielkość komórek waha się między 50 do 70 µm, wielkość ziaren złoża powinna mieścić się w granicach od 250 do 350 µm. Oprócz standardowych własności, stosowane złoże nie może być w żaden sposób „toksyczne” w stosunku do komórek, a dodatkowo musi ono zachować stabilność w warunkach sterylizacji lub autoklawowania [4].

Autor: Lidia Koperwas

Literatura:

[1]. Kahlenberg A., Walker C., 1976. Preparative isolation of band 3, the predominant polypeptides of the human erythrocyte membrane. Anal. Biochem., 74 : 337-342.
[2]. Porath J., Carlsson J., Olsson I., Belfrage G., 1975. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature, 258: 598 – 599
[3]. Kłyszejko-Stefanowicz L, 2003. Ćwiczenia z biochemii. Wydawnictwo Naukowe PWN, 2003, s. 164-166
[4]. www.zba.wbbib.uj.edu.pl/Skrypt/3.pdf
[5].http://www.kns.b2me.pl/art-metody-stosowane-w-pomiarach-wlasciwosci-erytrocytow,122,0.html
[6].http://www.merckmillipore.com/poland/chemicals/kwas-iminodioctowy-sol-disodowa-monohydrat/MDA_CHEM-841784/p_8bab.s1LNvsAAAEWiOEfVhTl