Związki selenoorganiczne zostały po raz pierwszy otrzymane w 1847 roku. Jednak dopiero na początku lat 70 XX wieku znalazły one zastosowanie w syntezie organicznej. Na podstawie dotychczasowych badań stwierdzono, że związki selenoorganiczne odznaczają się licznymi interesującymi właściwościami biologicznymi. Wykazano, że niektóre benzizoselenazol-3(2H)-ony, a także diselenidy są aktywnymi immunostymulantami, antyoksydantami, mimetykami peroksydazy glutationowej a także środkami o działaniu przeciwwirusowym, przeciwbakteryjnym, przeciwgrzybiczym oraz przeciwzapalnym. Odkrycie to pozwoliło nadać nowy kie­runek badaniom nad związkami selenu projektowanymi jako leki, inhibitory enzymów, mimetyki oraz immunomodyfikatory [1].

Przez lata jedynymi związkami selenoorganicznymi testowanymi jako środki przeciwwirusowe były analogi nukleozydów, których rola polegała na blokowaniu procesu replikacji czy też transkrypcji materiału genetycznego wirusów [1]. Badania w ostatnich latach wykazały, że syntetyczne związki selenoor­ganiczne pochodne benzizoselenazol-3(2H)-onów i diselenidów, które posiadają struktury odmienne od testowanych do tej pory, także mogą hamować efekt cytopatyczny wirusów. Związki te mają możliwość stać się środkami przeciwwirusowymi nowej generacji. Wymaga to jednak prowadzenia skrupulatnych i regularnych badań, które doprowadzą do określenia relacji struktura-aktywność. Pozwoli to na otrzymanie właściwych związków selenoorganicznych oraz zaprojektowanie ich me­chanizmu działania na poziomie molekularnym [2].

Aktywność biologiczna związków selenoorganicznych

Selen jest niezbędnym składnikiem organizmu ludzkiego. Występuje on we wszystkich jego komórkach w połączeniu z aminokwasami, cysteiną (selenocysteina) i metioniną (selenometionina) oraz w związkach z białkami. Selen wchodzi w skład około 20 enzymów. Jednym z najważniejszych enzymów zawierających selen jest peroksydaza glutationowa, która bierze udział w metabolizmie nadtlenku wodoru i chroni przed utlenianiem lipidów. Jako przeciwutleniacz selen uczestniczy w procesach metabolicznych na poziomie komórkowym, chroniąc błony komórkowe przed wolnymi rodnikami, dzięki czemu zmniejsza ryzyko wystąpienia nowotworów, chorób serca i naczyń krwionośnych. Jest niezbędny do prawidłowego funkcjonowania układu immunologicznego oraz przekazywania impulsów nerwowych w ośrodkowym układzie nerwowym. Ponadto wykazuje on działanie przeciwwirusowe, przeciwbakteryjne, przeciwgrzybicze oraz przeciwzapalne. Niedobór selenu powoduje zmniejszenie aktywności peroksydazy glutationowej selenozależnej. Sprzyja także chorobie mięśnia sercowego, układu krążenia, kostnego, nowotworom, infekcjom i przeziębieniom. Zarówno niedobór jak i nadmiar selenu jest szkodliwy dla organizmu [3].

Przez długi czas selen i jego połączenia były uważane za silną truciznę. Dopiero odkrycie w 1973 roku, że dwa bakteryjne enzymy zawierają selen spowodowało wzmożenie badań nad zastosowaniem tego pierwiastka. Poczyniono wiele badań w kierunku syntezy związków selenu i użyciem ich jako antyutleniaczy, induktorów cytokin, czynników antyinfekcyjnych, inhibitorów enzymów czy immunomodulatorów. Do związków selenoorganicznych posiadających aktywność biologiczną można zaliczyć [4]:

· pochodne benzizoselenazol-3(2H)-onów, o ogólnym wzorze:

· diselenidy diarylowe i dialkilowe:

R¹SeSeR², gdzie R¹, R² – alkil, aryl

· selenidy dialkilowe i diarylowe:

R¹SeR², gdzie R¹, R² – alkil, aryl

W ostatnich latach przeprowadzono liczne badania w celu określenia zależności pomiędzy strukturą związków selenoorganicznych, głównie benzizoselenazol-3(2H)-onów, a ich aktywnością przeciwwirusową. Przedstawiono projekt grupy związków, które zawierały liczne modyfikacje strukturalne w pierścieniu benzenowym wyjściowego benzizoselenazol-3(2H)-onu. Ukierunkowane modyfikacje strukturalne głównego związku z grupy benzizoselenazol-3(2H)-onów – 2-fenylobenzizoselenazol-3(2H)-onu (ebselenu) ogarnęły pierścień izoselenazol-3(2H)-onu, zwarty z nim pierścień benzenowy, a także podstawniki na atomie azotu (Rys. 1). Uzyskane pochodne ebselenu dały powód do dyskusji dotyczącej zależności między strukturą związku a jego aktywnością przeciwwirusową [5].

Rys.1. Modyfikacje struktury wiodącej ebselenu.

Metoda syntezy benzizoselenazol-3(2H)-onów (5) i ich analogów polega na przeprowadzeniu kwasów podstawionych w pozycji orto grupą aminową (1) bądź  atomem chloru (2) we właściwe chlorki 2-(chloroseleno)benzoilu (4), a następnie na tandemowej reakcji selenenylowania-acylowania z pierwszorzędowymi aminami. Tak uzyskane benzizoselenazol-3(2H)-ony (5) przy użyciu wodzianu hydrazyny mogą być zredukowane do diselenidów (6) (Rys.2). Benzizoselenazol-3(2H)-on (R² = H) reagując z izocjanianami, zapewnia właściwe pochodne karbamoilowe, natomiast jego sól potasowa w reakcji z halogenopochodnymi różne N-podstawione benzizoselenazol-3(2H)-ony [5].

Ogólną metodą syntezy benzizoselenazol-3(2H)-onów podstawionych w pierścieniu homoaromatycznym jest przeprowadzenie podstawionych pochodnych kwasu 2 chlorobenzoesowego lub antranilowego we właściwe chlorki 2-(chloroseleno)benzoilu, a następnie na ich reakcji tandemowego selenenylowania-acylowania z aminami pierwszorzędowymi. Dla syntezy 5-aminoacylobenzizoselenazol-3(2H)-onów przygotowano oddzielny sposób syntezy, który obejmuje selektywną redukcję grupy nitrowej [5].

Rys. 2. Synteza benzizoselenazol-3(2H)-onów (5) oraz diselenidów (6).

Związki selenoorganiczne mogą być badane za pomocą rezonansu selenowego ⁷⁷Se-NMR (spin jądrowy ½, rozpowszechnienie izotopu 8%). W metodzie tej wartości przesunięcia chemicznego są zależne od stosowanego rozpuszczalnika. Jako wzorzec zewnętrzny stosowany jest zazwyczaj roztwór selenidu dimetylowego w CDCl₃ o umownej wartości przesunięcia chemicznego δ_77Se = 0 ppm oraz roztwór (PhSe)₂ w CDCl₃, którego δ_77Se = 463 ppm. Zaletami techniki ⁷⁷Se NMR są diagnostyczne stałe sprzężenia z jądrami ¹H, ¹³C i ³¹P oraz szeroki zakres wartości przesunięć chemicznych wynoszący ok. 3300 ppm, dzięki czemu istnieje małe prawdopodobieństwo nakładania się sygnałów. Technika ⁷⁷Se NMR pozwala na badania konformacyjne związków selenoorganicznych w znacznie wyższych temperaturach (wyższe temperatury koalescencji) niż spektroskopia ¹H i ¹³C NMR. Ponadto czułość techniki ⁷⁷Se NMR jest porównywalna z czułością techniki ¹³C NMR i nie wymagane jest wzbogacenie izotopowe próbki [6].

Wykazano aktywność przeciwwirusową związków selenoorganicznych względem trzech wirusów należących do różnych grup systematycznych. Należą do nich: HSV-1 - wirus opryszczki typu 1 (posiadający osłonkę wirus DNA z rodziny Herpesuiridae), EMCV - wirus zapalenia mózgu i mięśnia sercowego (nieposiadąjący osłonki wirus RNA z rodziny Picornaviridae) oraz VSV - wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej (posiadający osłonkę wirus RNA z rodziny Rhabdouiridae). Miarą aktywności przeciwwirusowej jest minimalne stężenie hamujące rozwój wirusa (MIC). Jest ono zdefiniowane jako najmniejsze stężenie związku, które  powoduje spadek miana wirusa o 100 (dla HSV-1) bądź 1000 (dla EMCV i VSV) w stosunku do próby kontrolnej [5].

Modyfikacje strukturalne benzizoselenazol-3(2H)-onów a ich aktywność przeciwwirusowa

• Modyfikacje w pierścieniu izoselenazol-3(2H)-onu

W celu udowodnienia aktywności przeciwwirusowej selenu zsyntezowano właściwe benzizoselenazol-3(2H)-ony i ich izostrukturalne analogi, gdzie atom selenu został zastąpiony siarką, ugrupowaniem metylenowym lub karbonylowym. Często pewne właściwości związków organicznych selenu są zbliżone do siarkowych analogów [5].

Stwierdzono wysoką aktywność przeciwwirusową związków selenoorganicznych wobec wirusów EMCV (MIC 4-10 µg/ml) i  HSV-1 (MIC 2-8 µg/ml) oraz zupełną nieaktywność w stosunku do VSV (MIC > 1000 µg/ml). Natomiast siarkowe analogi benzizoselenazol-3(2H)-onów były  nieaktywne wobec VSV i EMCV (MIC > 1000 µg/ml). Wobec HSV-1 ich aktywność była dużo słabsza niż właściwych  analogów seleno­wych (MIC 80-1000 µg/ml). Do zupełnej utraty aktywności przeciwwirusowej doprowadziła zamiana atomu selenu na grupę karbonylową lub metylenową. Uzyskane wyniki potwierdzają jak ważna jest rola selenu na oddziaływanie przeciwwirusowe [5].

Tabela 1. Aktywność przeciwwirusowa benzizoselenazol-3(2H)-onów oraz ich izostrukturalnych analogów

Na podstawie uzyskanych wyników przeprowadzono badania polegające na zaangażowaniu selenu w oddziaływania biologiczne z innymi  połączeniami,  takimi jak funkcja selenidowa czy też diselenidowa. W wyniku tego otworzono pierścień izoselenazol-3(2H)-onu, gdzie otrzymano szereg otwartopierścieniowych pochodnych benzizoselenazol-3(2H)-onów i diselenidów, zsyntezowano również kilka pochodnych selenidowych. Wykazano, że  cykliczne benzizoselenazol-3(2H)-ony i otwartopierścieniowe diselenidy posiadają wysoką aktywność wobec wirusów EMCV i HSV-1 (MIC 2—40 µg/ml), natomiast selenidy były zupełnie nieaktywne (MIC > 1000 µg/ml). Wyniki te pozwalają wysnuć hipotezę, że aktywność przeciwwirusowa wiąże się głównie z możliwością dostępności atomu selenu w reakcjach z grupami tiolowymi biologicznych receptorów oraz zdolności tworzenia wiązania Se-S [5].

• Modyfikacje na atomie azotu

Uzyskanie benzizoselenazol-3(2H)-onów posiadających swoiście dobrane N-podstawniki miało za zadanie stwierdzenie wpływu różnych grup funkcyjnych na poziom aktywności przeciwwirusowej. Dlatego wprowadzono na atom azotu grupy: alkilowe, acylowe, arylowe, heteroarylowe, karbamoilowe, alkiloestrowe, a także hydroksy,- karboksy- i amino alkilowe [5].

Tabela 2. Aktywność przeciwwirusowa N- podstawionych benzizoselenazol-3(2H)-onów.

W przypadku alkilowych jak i arylowych analogów pochodnych benzizoselenazol-3(2H)-onów, aktywność przeciwwirusowa dotyczyła tylko wirusów HSV-1 oraz EMCV ponieważ związ­ki te posiadały wysoką aktywność anty-HSV-1 i anty-EMCV (MIC 2-10 µg/ml). Wyjątek stanowiły pochodne: adamantylowa oraz trotylowa, których aktywność była znacznie  niższa (MIC > 100 µg/ml). Przypuszczalnie jest to związane z prze­szkodą sferyczną utworzoną przez w miarę duże podstawniki. Nieaktywne pozostały także pra­wie wszystkie pochodne pirydynowe. Pokaźną aktywność wobec wszystkich trzech wirusów (MIC_HSV = 20 µg/ml, MIC_EMCV = 20 µg/ml, MIC_VSV = 80 µg/ml), wykazał N-metylojodek 2-(3-pirydylo)benzizoselenazol-3(2H)-onu [5].

Metylojodki 119 są aktywniejszymi czynnikami przeciwwirusowymi aniżeli ebselen 6. Działają one jako inhibitory wirusa opryszczki (HSV-1), a także wirusa zapalenia mózgu i mięśnia sercowego (EMCV). Wartości minimalnego stężenia hamującego MIC obejmowały zakres 0,4-6,0 µg/ml. Wirus pęcherzykowatego zapalenia błony jamy gębowej bydła (VSV) był oporny na większość związków selenoorganicznych. Wyjątek stanowił umiarkowanie aktywny metylojodek 120 [5].

Wysoką aktywność anty-HSV-1 (MIC 4-8 µg/ml) i anty-EMCV (MIC 4-8 µg/ml) posiadały pochodne, które zawierały krótkie łańcuchy alkilowe. Natomiast długołańcuchowe podstawniki alkilowe przyczyniały się do spadku aktywności związków (MIC > 1000 µg/ml). Przypuszczalnie ma na to wpływ ich słaba rozpuszczalność, następstwem czego była obniżona biodostępność. W stosunku do wszystkich przebadanych związków wirus VSV wykazał zupełną oporność [5].

Natomiast w grupie pochodnych, które  zawierały  N-podstawniki mające dodatkowe moduły funkcyjne, związki zawierające grupy estrowe, karbamoilowe, hydroksylowe i aminowe posiadały wysoką aktywność anty-HSV-1 (MIC 2-60 µg/ml) i anty-EMCV (MIC 4-100 µg/ml). Zaobserwowano jednak znaczny spadek aktyw­ności wśród analogów karboksylowych [5].

• Modyfikacje w pierścieniu benzenowym

Wprowadzenie hetero­cyklicznego atomu azotu i dodatkowych podstawników na atomie wę­gla C-5, takich jak: chlor, grupa nitrowa, metylowa i metylosulfonowa, przyczyniło się do otrzymania modyfikacji pierścienia benzenowego skondensowanego z pier­ścieniem izoselenazol-3(2H)-onu. Prawdopodobnie obecność różnych podstawników w pierścieniu ben­zenowym może spowodować dodatkowe międzycząsteczkowe oddziaływania, co może w dużej mierze wpływać na aktywność przeciwwirusową. Wzmocnienie siły oddziaływania związku z receptorem biologicznym może nastąpić również przez wprowadzenie heterocyklicznego atomu azotu, a w następstwie wytworzenie kolejnego miejsca wodoroakceptorowego [5].

Tabela 3. Aktywność przeciwwirusową C5-podstawionych benzizoselenazol-3(2H)-onów.