Akceptuję
W ramach naszej witryny stosujemy pliki cookies w celu świadczenia państwu usług na najwyższym poziomie, w tym w sposób dostosowany do indywidualnych potrzeb. Korzystanie z witryny bez zmiany ustawień dotyczących cookies oznacza, że będą one zamieszczone w Państwa urządzeniu końcowym. Możecie Państwo dokonać w każdym czasie zmiany ustawień dotyczących cookies. Więcej szczegółów w naszej Polityce Prywatności

Zamknij X
Strona główna Artykuły

Metody izolacji białek związanych z DNA i RNA cz.I

Wśród metod izolacji kwasów nukleinowych bardzo często można spotkać także metody, w których izoluje się charakterystyczne dla kwasów nukleinowych białka tj. rybo nukleoproteiny i deoksyrybonukleoproteiny. Obecnie znanych jest wiele różnych metod izolacji tych białek, jednak najlepsze z nich opierają się na badaniach Mirsky’ego (1971), uważanego za pionierskiego badacza w dziedzinie nukleoprotein. Pierwsze wiadomości odnośnie białek związanych z RNA datuje się od doniesień Cramptona (1959).

Dzięki szeroko przeprowadzonym badaniom, dziś już znane są główne funkcje białek związanych z kwasami nukleinowymi.

Słowa kluczowe:  nukleoproteiny (NP), rybonukleoproteiny (RNP), deoksyrybonukleoproteiny (DNP), białka NHC (NHCP), białka resztkowe DNP, histony, białka rybosomowe, protaminy, białka niehistonowe.


Białka wiążące DNA pełnią wiele ważnych funkcji w organizmie. Biorą udział w procesie ekspresji genomu, a dodatkowo spełniają funkcje strukturalne w chromosomach prokariotycznych i eukariotycznych, a także w procesie replikacji naprawy DNA. Duże znaczenie maja też białka wiążące się z RNA [4].

 Aby specyficznie wiązać się z podwójną helisą, białko musi wejść z nią w kontakt, dzięki czemu umożliwione będzie poznanie przez niego sekwencji kwasu nukleinowego. W większości przypadków, działanie takie umożliwione jest dzięki penetracji większego lub mniejszego rowka DNA- tak by możliwy był bezpośredni odczyt sekwencji. Zazwyczaj towarzyszą temu mniej specyficzne oddziaływania z powierzchnią cząsteczki DNA. Przeważnie wpływają one na stabilizację kompleksu białko-DNA [4].

Nukleoproteiny (NP) określane są jako trójwymiarowe połączenia dwojakiego rodzaju wielkocząsteczkowych amfolitów. Tak więc połączenia te obejmują kwas nukleinowy (DNA lub RNA) i białka, które sprzężone są ze sobą za pomocą bardziej- lub mniej trwałych wiązań. Charakter komponentu nukleinowego tj. DNA lub RNA, które uważane są za grupę prostetyczną nukleoprotein, determinuje istnienie w materiale biologicznym dwóch rodzajów białek tj. rybonukleoprotein (RNP) oraz deoksyrybonukleoprotein (DNP) [2].

Badania nad nukleoproteidami  datuje się od 189 roku. Wtedy to Miescher otrzymał z leukocytów złożoną substancję, która bogata była w fosfor i azot. Tak więc substancja ta nazwana została nukleiną , dla podkreślenia jej jądrowego pochodzenia. Analogiczne substancje zostały także wyizolowane z tkanek charakteryzujących się dużymi jądrami komórkowymi, tak więc wśród nich znalazły się plemniki łososia, ptasie erytrocyty czy grasica. W toku licznych badań Miescher zasugerował, że nukleina pochodząca z nasienia łososia jest solą jakiegoś kwasu (bogatego w fosfor)  z organiczną zasadą azotową. Sól ta została nazwana przez Miescher’a protaminą.

Z kolei, Altmann (1889) zaproponował termin „kwas nukleinowy” jako nazwa dla kwasu związanego z solą, dzięki czemu zróżnicowano kwas nukleinowy wyizolowany przez Altmann’a z komórek  drożdży (tj. kwas nukleinowy drożdżowy- „roślinny”), od kwasu nukleinowego grasicowego („zwierzęcego”). Nazwy te przez wiele lat były błędnie używane dla określania kwasu rybonukleinowego (RNA) i deoksyrybonukleinowego (DNA), występujących zarówno w komórkach roślinnych jak i zwierzęcych [2].

W 1884 roku Kossel wyizolował z jąder komórkowych erytrocytów ptasich  inne białko zasadowe, które nazwał histonem.  Kossel także udowodnił białkowy charakter protaminy. Protaminy i histony przez długi czas uważane były za jedyne białka DNP. W 1914 roku Steudel, obserwując mniejsza zawartość histonów w porównaniu z całkowitą ilością białka w DNP zasugerował, że istnieje jeszcze inny komponent białkowy, który jest sprzężony z DNA.  I tak od lat 40. W literaturze pojawiło się dużo różnych określeń tego składnika [2].

Aktualnie w terminologii naukowej, pozostałości jąder komórkowych po wyekstrahowaniu RNP i DNP określa się jako białka resztkowe jąder komórkowych lub białko kwasowe pozachromatynowe. Z kolei białka kwasowe DNP  lub chromatyny określa się jako białka kwasowe chromatyny albo białka niehistonowe chromatyny (tj. białka NHC lub NHCP) [2].
Pomimo, iż DNP ekstrahuje się z jąder komórkowych od końca XIX wieku, to dopiero w 1961 roku Bonner i wsp. zaczęli utożsamiać ekstrakt DNP z chromatyną [2].
Z kolei, pierwsze wiadomości na temat białek związanych z RNA datuje się od doniesień Cramptona (1959) i Petermana (1959), dotyczących składu aminokwasowego białek zasadowych, które to otrzymano ekstrahując cytoplazmatyczne cząstki rybonukleoproteinowe wątroby szczura rozcieńczonymi kwasami [2].

Białka związane z RNA

Białka związane z RNA to przede wszystkim białka rybosomowe, a to ze względu na dużą ilość rybosomów w komórce eukariotycznej. Rybosomy często stanowią nawet ok. 50% objętości komórki. Rybosomy cytoplazmatyczne charakteryzują się stosunkiem wagowym białko/RNA równym 1:1.

Białka RNP ekstrahuje się zazwyczaj stosując stężone roztwory mocznika , 66% roztwór CH3COOH lub rozcieńczony kwas solny (HCl).  Ponadto, stosuje się także trawienie rybosomów RNazą w 0.1 M buforze Tris/HCl.  Masy cząsteczkowe tych białek wahają się w granicach 10 – 50 kDa.  W składzie białek wyróżnia się ok. 18-23 mol% zawartości aminokwasów zasadowych, ze stosunkiem Lys/Arg bliskim 1.2, a także suma aminokwasów kwasowych (tj. 17-20 ml %) [2].

Rybonukleoproteiny występują w komórce zarówno w jądrze komórkowym, jak i w cytoplazmie. Rybonukleoproteiny można podzielić na:

1)  jądrowe RNP, a wśród nich wyróżnia się rybo nukleoproteiny jąderkowe i pozająderkowe oraz
2) cytoplazmatyczne RNP, a wśród nich: rybo nukleoproteiny rybosomowe i pozarybosomowe, a także RNP mitochondriów i RNP chloroplastów (u roślin) [2], [8].

Pod względem wielkości RNP można sklasyfikować jako: RNP wysoko- i niskocząsteczkowe.
Wysokocząsteczkowe RNP stanowią głównie prerybosomowe RNP (pre-rRNP), rybosomowe RNP (rRNP), pre-mRNP inaczej określane hnRNP (niejednorodne jądrowe RNP) [2], [8].

Niskocząsteczkowe RNP to z kolei: małe RNP (sRNP- small RNP), wśród których wyróżnia się: rRNP tj. rybo nukleoproteiny zawierające małe rybosomowe RNA, snRNP tj. małe jądrowe RNP, małe jąderkowe RNP (tj. snoRNP) oraz małe cytoplazmatyczne RNP (scRNP-small cytoplazmie RNP), które utworzone są z udziałem scRNP [2], [8].

Małe jądrowe rybonukleoproteiny stanowią grupę białek ściśle związanych ze składaniem i dojrzewaniem cząsteczek RNA i są umiejscowione w miejscach aktywnej transkrypcji [9].

Podczas izolacji białek związanych zarówno z DNA jak i z RNA tj. RNP i DNP, wszystkie zabiegi przeprowadza się w niskiej temperaturze. Tak więc homogenizacja, ekstrakcja i wirowanie odbywają się w temperaturze od 0˚C do 4˚C, najczęściej więc zabiegi te przeprowadza się w chłodni, lodówce lub w pojemniku z rozdrobnionym lodem. Używane w trakcie izolacji narzędzia i naczynia także są wcześniej chłodzone. Działania takie są niezbędne ze względu na dużą podatność zarówno komponentu nukleinowego jak i białkowego na degradację termiczną i enzymatyczną ( zwłaszcza pod wpływem proteinazy chromatynowej. Niska temperatura zmniejsza aktywność wielu enzymów [2].

Ekstrakcja RNP [2].

Metody izolowania RNP za pomocą rozcieńczonych zasad (np. 3% NaOH, 0.75 M NaOH), czy wodą z dodatkiem NaHCO3, bądź lekko zasadowymi roztworami buforowymi (np. bufor boranowy o pH=8.4), aktualnie wyszły już z użycia, ze względu na możliwość jednoczesnej ekstrakcji DNP degradację nukleoprotein [2].
Obecnie stosowane metody można podzielić na dwie kategorie:
1)    ekstrakcja RNP izotonicznymi roztworami soli
2)    frakcjonowane wirowanie homogenatów komórkowych.

Ekstrakcja RNP izotonicznymi roztworami soli [2].

Metody ekstrakcji z zastosowaniem izotonicznych roztworów soli cechują się pewną selektywnością. Wykorzystują one rozpuszczalność nukleoprotein w różnych stężeniach NaCl, a przede wszystkim nierozpuszczalność DNP w 0.14 M NaCl przy braku zmian rozpuszczalności RNP zależnie od stężenia NaCl. Najczęściej w metodach tych stosowany jest 0.14 M roztwór NaCl ( o pH= 7). W przypadku gdy z jednej porcji tkanki chce się otrzymać zarówno RNP jak i DNP, wtedy do roztworów ekstrahujących dodaje się inhibitorów DNazy. Wśród  tych inhibitorów stosuje się np. cytrynian sodu  w stężeniu 0.01- 0.05 M, NaF 0.1 M czy 0.1 M roztwór EDTA.  Tkanki, które są szczególnie bogate w RNP np. wątroba, trzustka czy nerki, wymagają wielokrotnej 20-30 minutowej ekstrakcji , aż do momentu braku strątu białkowego  z 5% roztworem CCl3COOH , ewentualnie do ujemnej reakcji na tryptofan  w wyciągu, podczas gdy dla materiału o dużej wartości stosunku jądrowo- cytoplazmatycznego wystarczy 2-krotne przemycie odpowiednim roztworem [2].

Otrzymywanie białek RNP metodą frakcjonowanego wirowania [2].

Zastosowanie tej techniki pozwala na uzyskanie czystej frakcji rybosomów cytoplazmatycznych lub rybosomów jądrowych [2].
Homogenat komórek lub jąder komórkowych zawieszonych w roztworze 0.25 M sacharozy lub w 0.05-0.1 M buforze  Tris/HCl (o pH= 7) poddaje się wirowaniu przy 20 000 – 30 000 x g przez 30 minut. Ma to na celu oddzielenie cięższych cząsteczek. Następnie, poddanie otrzymanego supernatantu  ultrawirowaniu  przy 78 000 x g ( 3 godziny) ,  105 000 x g (1,5 godziny) bądź 150 000 x g przez 1 godzinę, dostarcza osadu rybosomowego, który z kolei stanowi główna masę rybonukleoprotein komórkowych [2].

Wydzielenie RNP z roztworów soli [2].

Z roztworów soli rybo nukleoproteiny strąca się poprzez dodanie kwasu. Najczęściej jest nim CH3COOH lub HCl do pH= 4-5. Można także zastosować oziębiony 96% roztwór etanolu (tj. 1-2 objetości). Ważne jest by możliwie jak najszybciej oddzielić strąt RNP od supernatantu , w celu uniknięcia rozkładu nukleoprotein w środowisku kwasowym lub alkoholowym. W przypadku gdy uzyskany preparat RNP ma być poddany analizie chemicznej , otrzymany strąt RNP przemywa się etanolem, nastepnie mieszaniną etanolu i eteru , a na końcu eterem, po czym suszy się go w próżni nad stężonym roztworem H2SO4 lub bezwodnym CaCl2 [2].

Izolowanie RNA i białka z preparatów RNP [2].

W celu przeprowadzenia ekstrakcji RNA lub białek  używa się świeżo uzyskanych i nieodwadnianych strątów RNP lub frakcji rybosomowej  [2].

Izolowanie rybonukleoprotein z grasicy  lub trzustki bydlęcej [1], [2].

Grasica lub trzustka powinny być jak najszybciej zamrożone w termosie z lodem po pobraniu z organizmu zwierzęcia i przechowywane w takim stanie do momentu rozpoczęcia preparatyki  [1].

1.Ekstrakcja RNP [1], [2].

Świeżą tkankę grasicy (ok. 15 g) bardzo dokładnie oczyszczoną z tłuszczu oraz błon łącznotkankowych a także przemytą roztworem SSC (tj. sodium chloride + sodium citrate: 0.14 M roztwór NaCl w 0.014 M roztworze cytrynianu sodu , pH= ok.7), pociąć na drobne kawałki, używając w tym celu nożyczek. Następnie próbkę homogenizować z dwoma objętościami SSC przez 30 sekund.  Homogenat przenieść do probówek wirówkowych, umieszczonych w łaźni lodowej , a następnie mieszać szklaną bagietką prze 20 minut. Odwirować ( ok. 1000 x g, 10 minut) [1], [2].
Otrzymany supernatant ostrożnie zlać jednym ruchem do małej zlewki:  do 1 ml supernatantu dodać 1 ml 20% roztworu CCl3COOH, po czym obserwować pojawienie się strątu świadczącego o obecności RNP [1], [2].

Ekstrakcję RNP ( wg opisanej metody) przeprowadzić 2-3 razy, aż do momentu gdy w supernatancie nie będzie widoczny strąt z roztworem CCl3COOH (20%).  Następnie, z połączonych supernatantów (zlanych do erlenmejerki umieszczonej w lodzie) strącić RNP przez zakwaszenie roztworu za pomocą HCl  do pH= 4-5. Po upływie ok. 30 minut otrzymany strąt odwirować przy ok. 15 000 x g przez 10 minut, a dalej rozpuścić w roztworze SSC [1], [2].

2.Otrzymanie preparatu RNP [1], [2].

Rozpuszczony w roztworze SSC RNP należy odwirować (ok. 1500 x g, 10 minut).  Otrzymany supernatant przenieść do nowej probówki wirówkowej i dodać 2 objętości oziębionego 96% etanolu. Odstawić do lodówki na ok. 30 minut. Po tym czasie strąt RNP odwirować (1000 x g, 5 minut), przemyć 96% roztworem etanolu i mieszaniną etanol-eter ( w stosunku 3:1), a na koniec eterem, za każdym razem odwirowując (1000 x g, 5 minut). Osad suszyć w strumieniu ciepłego powietrza  (np. za pomocą suszarki fryzjerskiej) [1], [2].

Ze względu na dużą labilność nukleoprotein (nawet w temperaturze pokojowej), wszystkie etapy izolacji należy przeprowadzać w pojemnikach umieszczonych na lodzie, a także stosując ochłodzone narzędzia. Probówki, w których odwirowuje się próbki powinny być także ochłodzone [1], [2].


Autor: Lidia Koperwas

Literatura:

[1]. Nucleoproteins of cell nuclei. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 28:344-352Mirsky A.E., Pollister A.W., 1942.
[2]. Kłyszejko-Stefanowicz L, 2003. Ćwiczenia z biochemii. Wydawnictwo Naukowe PWN, 2003, s. 332-358
[3]. Wang T.Y., 1967. The isolation , properties, and possible functions of chromatin acidic proteins. J. Biol. Chm., 242: 1220-1226.
[4]. Brown T.A, 2001. Białka wiążące DNA, rozdział 7, s. 163-165. Wydawnictwo Naukowe PWN.
[5]. Pollister A.W.,Leuchtenberger C., 1948. The Nucleoprotein Content Of Whole Nuclei DEPARTMENT OF ZOOLOGY, COLUMBIA UNIVERSITY Communicated by L. C. Dunn, December 3, 1948
VOL. 35, 1949 ZOOLOGY.
[6]. Wiland E., Żegało M., Kurpisz M, 2006. Topologia chromosomów w jądrze komórkowym. Plemnik. Część 2. Postepy Hig Med Dosw. (online), 2006; 60: 343-351
[7]. Mariño-Ramirez L., Kann M.G., Shoemaker B.A., Landsman D., 2005. Histone structure and nucleosome stability. Expert Rev. Proteomics 2 (5), 719-729 (2005).
[8]. Tamás Kiss, 2004. Biogenesis of small nuclear RNPs. Journal of Cell Science 117 (25), 5949-5951
Published by The Company of Biologists 2004
[9]. Żegało M, Wiland E, Kurpisz M, 2006. Topologia chromosomów w jądrze komórkowym. Diploidalna komórka somatyczna. Część 1. Postepy Hig Med Dosw. (online), 2006; 60: 331-342.
[10]. http://www.e-biotechnologia.pl/Artykuly/Histony/


Tagi: nukleoproteiny (NP), rybonukleoproteiny (RNP), deoksyrybonukleoproteiny (DNP), białka NHC (NHCP), białka resztkowe DNP, histony, białka rybosomowe, protaminy, białka niehistonowe, lab, laboratoria, laboratorium.
Drukuj PDF
wstecz Podziel się ze znajomymi

Recenzje



znajdz nas na fcb
Informacje dnia: Potwierdzono - składniki diety mogą powodować migreny Biomarkery prognostyczne postępów cukrzycy Białe wino może zwiększać ryzyko czerniaka Dawne antybiotyki we współczesnej terapii Garść orzechów chroni przed wieloma chorobami Czynnościowa rola białek Potwierdzono - składniki diety mogą powodować migreny Biomarkery prognostyczne postępów cukrzycy Białe wino może zwiększać ryzyko czerniaka Dawne antybiotyki we współczesnej terapii Garść orzechów chroni przed wieloma chorobami Czynnościowa rola białek Potwierdzono - składniki diety mogą powodować migreny Biomarkery prognostyczne postępów cukrzycy Białe wino może zwiększać ryzyko czerniaka Dawne antybiotyki we współczesnej terapii Garść orzechów chroni przed wieloma chorobami Czynnościowa rola białek

Partnerzy

GoldenLine Fundacja Kobiety Nauki Warszawskie Stowarzyszenie Biotechnologiczne (WSB) „Symbioza” Obywatele Nauki NeuroSkoki Biomantis Uni Gdansk MULTITRAIN I MULTITRAIN II Nauki przyrodnicze KOŁO INZYNIERÓW PB ICHF PAN FUNDACJA JWP NEURONAUKA BIOOPEN 2016 QDAY Mlodym Okiem Nauka w Polsce CITTRU - Centrum Innowacji, Transferu Technologii i Rozwoju Uniwersytetu Akademia PAN Chemia i Biznes Farmacom Świat Chemii Forum Akademickie Biotechnologia     Geodezja „Pomiędzy naukami – zjazd fizyków i chemików” WIMC WARSZAWA 2016 Konferencja Biomedyczna Projektor Jagielloński Instytut Lotnictwa EuroLab