Oznaczanie stężenia wapnia całkowitego

Jest to podstawowe badanie laboratoryjne, wykorzystywane w diagnostyce zaburzeń gospodarki wapniowej. W tym celu wykorzystywane są metody chemiczne, w których jak materiał do badań służy surowica lub osocze heparynizowane. W oznaczeniu należy brać pod uwagę fakt, że wszystkie powszechnie stosowane antykoagulanty (EDTA, cytrynian sodowy, szczawian sodowy) chelatują jony wapniowe [4]. Podczas interpretacji otrzymanych wyników brane są pod uwagę zmiany stężenia białka- w tym głównie albuminy, które wpływają na zmianę stężenia wapnia całkowitego, przy jednoczesnym nie wpływaniu na zmianę stężenia fizjologicznie istotnego wolnego jonu wapniowego [4].

Oznaczanie wolnego jonu wapniowego (wapnia zjonizowanego)

Do oznaczania jonu wapniowego stosowane są elektrody jonoselektywne. Samo oznaczanie jonu wapniowego uważane jest za najlepszą metodę oceny kalcemii, pod warunkiem, że w trakcie oznaczenia w badanym materiale nie doszło do zmian pH. Ma to istotne znaczenie, ponieważ spadek stężenia jonu wodorowego (pH­) lub wzrost jego stężenia (pH¯) powodują odpowiednio wzrost lub spadek wiązania jonu wapniowego przez białka. Oznaczenie może być przeprowadzone w pełnej krwi heparynizwanej, w heparynizowanym osoczu lub w surowicy. Badanie w krwi heparyniozwanej powinno być przeprowadzone w ciągu 15 do 30 minut od momentu pobrania próbki krwi (najpóźniej w ciągu godziny). Jeżeli nie jest to możliwe, jako optymalny materiał do oznaczeń należy wybrać surowicę (osocze) [4].

Oznaczanie wapnia metodą kompleksometryczną (wg Krwaczyński J., i Osiński T., 1967)

Zasada powyższej metody opiera się na oznaczaniu wapnia przez bezpośrednie miareczkowanie solą dwusodową kwasu etylenodiaminotetraoctowego (wersenian sodowy, Na₂EDTA). Oznaczenie przebiega wobec wskaźnika fluoreksonu (kalceiny). Wersenian sodowy ma zdolność do wysycania wszystkich 6 miejsc koordynacyjnych jonu Ca²⁺ , tworząc odpowiedni chelatowy kompleks. Po związaniu wapnia przez wersenian dochodzi do zaniku zielonej fluorescencji, a pojawia się różowe zabarwienie, świadczące o końcu miareczkowania. Przy pH większym niż 12 obecność soli magnezu , żelaza oraz fosforanów (V) nie wpływa na zdolność oznaczania wapnia [3].

Kalceina (znana również jako fluorekson, fluorexon, komplekson fluoresceiny, oftasceina) jest barwnikiem fluorescencyjnym, która w czystej postaci występuje jako pomarańczowe kryształki. Kalceina jest wzbudzana światłem niebieskim, a jej maksimum absorpcji przypada przy długości fali równej λ = 495 nm. Maksimum emisji kalceiny wyznaczono przy długości fali λ = 515 nm (kolor zielony). W reakcji izotermalnej amplifiikacji kwasów nukleinowych związek ten stosowany jest jako barwnik umożliwiający wizualizację produktu bez konieczności otwarcia probówek z produktem reakcji [7].

Odczynniki:

1) Roztwór macierzysty wersenianu (Na₂-EDTA): 4% roztwór wersenianu disodowego

2) Roztwór roboczy wersenianu: macierzysty roztwór należy rozcieńczyć 100-krotnie

3) Macierzysty roztwór wzorcowy wapnia o stężeniu Ca 25 mmol/l: 2,497 g wysuszonego do stałej wagi w 110°C CaCO₃ należy rozpuścić w 100 ml wody i 50 ml 1 M roztworu kwasu solnego. Całość uzupełnić woda destylowaną (2x destylowaną) do 1000 ml.

4) Roboczy roztwór wzorcowy wapnia o stężeniu Ca 2,5 mmol/l: macierzysty roztwór rozcieńczyć 10-krotnie [3].  

Wykonanie:

Do 1,5 ml 3 M roztworu KOH należy dodać o,2 ml roztworu fluoreksonu wraz z 1 ml surowicy. W wyniku zachodzącej reakcji w roztworze pojawia się żółto-zielone zabarwienie z fluorescencją. Roztwór należy następnie miareczkować roboczym roztworem wersenianu do momentu, aż żółto-zielone zabarwienie z fluorescencją przejdzie w zabarwienie różowe (bez fluorescencji). W ten sam sposób przeprowadzić miareczkowanie próby kontrolnej (z wodą) i roztworu wzorcowego. Oznaczenie stężenia wapnia w moczu przeprowadza się w identyczny sposób jak dla surowicy [3].

W metodach miareczkowych, w których równolegle miareczkuje się próbę badaną i wzorcową, stężenie oznaczanej substancji (wapń) oblicza się w analogiczny sposób jak w kolorymetrii. Stężenie roztworu, którym się miareczkuje (roztwór wersenianu) nie jest istotne. W trakcie obliczania stężenia wapnia należy uwzględnić objętość wersenianu zużytą na miareczkowanie próby badanej (surowicy) oraz wzorcowej, jak również stężenie wzorca, w przypadku gdy do miareczkowania stosuje się jednakowe objętości surowicy i roztworu wzorcowego, albo odpowiednio obliczony mnożnik, gdy objętości te nie są jednakowe.

Stężenie wapnia w surowicy (w mmol/l surowicy) można obliczyć według poniższego wzoru:

mmol/l= ml Na₂EDTA  dla surowicy / ml Na₂EDTA dla wzorca x 2,5 [3].