Oznaczanie wapnia w surowicy i moczu metodą kolorymetryczną (wg Bagiński E.S i wsp., 1973)

Zasada metody

W środowisku zasadowym jony wapnia tworzą z kompleksonem o-krezoloftaleiny barwny związek, którego natężenie jest proporcjonalne do zawartości jonów wapnia w badanej próbce. Jako materiał do badań wykorzystuje się surowicę i mocz, który wcześniej należy 2-krotnie rozcieńczyć z wodą.

Wykonanie:

Do 0,02 ml surowicy lub rozcieńczonej próbki moczu (próba badana), 0,02 ml roztworu wzorcowego (próba wzorcowa tj.: roztwór o stężeniu 10 mg Ca²⁺ /100 ml, czyli 2,5 mM) należy dodać po 1 ml odczynnika barwnego (tj.: 0,062 mM metaloftaleina; 32,6 mM HCl; 1,41 M dimetylosulfotlenek (DMSO) i 17,2 mM 8-hydroksychinolina) oraz 1 ml buforu (tj.:7,67 mM KCN w 0,385 M dietyloaminie). Zawartość probówki dokładnie wymieszać, po czym zmierzyć wartość absorbancji próby badanej i wzorcowej wobec próby kontrolnej przy długości fali równej λ=575 nm. Powstałe w wyniku reakcji zabarwienie jest trwałe przez 30 minut. Należy mieć na uwadze, że powyższa reakcja jest bardzo czuła, przez co używane szkło i odczynniki muszą być bardzo czyste.

Stężenie wapnia można obliczyć wg poniższego wzoru:

Mmol Ca²⁺/l = (A_{próby badanej} /A_wzorca) x 2,5 mmol/l

mg Ca²⁺/ 100 ml = (A_{próba badana}/A_wzorca) x 10 mg/100 ml [3].

Zawartość wapnia w organizmie jest około 5-krotnie większa w porównaniu do sodu (przeciętnie ilość szacowana jest na poziomie  1000 g, z czego znaczna większość bo ponad 98% związana jest z fosforanami, tworząc tzw.  mineralną  część kośćca).  Około  1% z tej ilości stanowi pulę wymienialną, która może być szybko uzupełniona. Pozakomórkowa pula wapnia, osoczowa i międzykomórkowa, to około 22–23 mmol, z czego 40% znajduje się w osoczu, w większości związana z białkami (46%) oraz cytrynianami, fosforanami i innymi anionami buforującymi (6%). Stężenie wapnia rozpuszczonego w wodzie osocza oraz w wodzie pozanaczyniowych płynów pozakomórkowych podlega ścisłej regulacji. Podobnie jest ze stężeniem wapnia w cytoplazmie komórek.

Znane są metody oznaczania stężenia wapnia zjonizowanego w osoczu, w których wykorzystywane są elektrody jonoselektywne. Jednakże nadal większość laboratoriów oznacza stężenie wapnia całkowitego w osoczu, gdzie określa się łączne stężenie 3 frakcji:

wapń całkowity =  wapń zjonizowany + niebiałkowy niezjonizowany + wapń związany z białkami osocza,

gdzie: wapń zjonizowany i niebiałkowy niezjonizowany tworzą frakcję filtrowalną wapnia  osoczowego [9].

Stężenie wapnia we krwi stanowi wypadkową współdziałania wielu mechanizmów regulacyjnych. Na jego poziom mają wpływ reakcje zachodzące pomiędzy układem pokarmowym, nerkami i kośćmi. Wzrost poziomu wapnia we krwi objawia się tzw. zespołem hiperkalcemicznym, którego objawy mają wpływ na zaburzenie prawidłowego funkcjonowania nerek, serca, przewodu pokarmowego, ośrodkowego układu nerwowego, a także synaps nerwowo-mięśniowych [8]. Zmniejszenie stężenia wapnia całkowitego w surowicy okreslane jest mianem hipokalcemii. Do zmniejszenia podaży wapnia może dochodzić z powodu nieprawidłowych nawyków żywieniowych (np. unikania pewnych pokarmów), a  także w wyniku niekorzystnego stosunku wapnia do fosforu (który wynika z obecności fosforu w produktach często spożywanych, takich jak: mięso, drób, ryby, sery żółte czy ciemne pieczywo). W wyniku reakcji fosforu z wapnem powstaje źle wchłaniany fosforan wapniowy. Co więcej na ujemny bilans wapniowy znacząco wpływa także nadmierne spożycie soli kuchennej i związane z tym zwiększone wydalanie wapnia [12]. Wśród najlepiej znanych form uzupełniania niedoborów wapnia jest dostarczenie go z pożywieniem. Podstawowym, a także najbogatszym źródłem wapnia w przeciętnej diecie jest mleko oraz jego przetwory. Według badań, dostarczają one blisko 80% potrzebnego wapnia. Ponadto wykazano, że wapń pochodzący z mleka i jego przetworów bardzo dobrze wchłania się nawet przy braku witaminy D czy obniżonej ilości soku żołądkowego [12].

Bardzo duży wpływ na prawidłową gospodarkę wapnia w organizmie ma odpowiedni stosunek wapnia do fosforu w racji pokarmowej. Za najbardziej korzystny dla ludzi dorosłych uznano stosunek Ca:P jak 1:1, dla dzieci 1,2:1, a dla niemowląt 1,5:1. Uważa się, że stosunek wapnia do fosforu w racji pokarmowej może wychodzić poza te zakresy, o ile racja zawiera dostateczną ilość witaminy D, wspomagajęcej jego przyswajanie [13].

Autor: Lidia Koperwas

Literatura:

[1]. Florczak P., Gotowski R., Zukow W., Muszkieta R., Napierała M., Cieślicka M., Nalazek A., Hubert R., 2013. Rola witamin i soli mineralnych w wysiłku fizycznym.  Journal of Health Sciences. 2013;3(11):435-446. ISSN 1429-9623 / 2300-665X.

[2]. Celejowa I., 2008, Żywienie w sporcie, Wydawnictwo Lekarskie PZWL Warszawa, s. 54-71.

[3]. Kłyszejko-Stefanowicz L, 2003. Ćwiczenia z biochemii. Wydawnictwo Naukowe PWN, 2003, s.606-609.

[4]. Szutowicz A., Raszei-Szpecht A., 2009. Diagnostyka laboratoryjna. Tom I.Gdański Uniwersytet Medyczny, Zlecenie KW/224/09.Recenzent prof. dr hab.Wiesława Łysiak-Szydłowska. s. 156-163

[5]. Kuśnierz-Cabala B., Fedak D., Gurda-Duda A., Solnica B., Dumnicka P., Panek J., Kulig J., 2010. Znaczenie diagnostyczne zmian stężenia wapnia u chorych z ostrym zapaleniem trzustki. diagnostyka laboratoryjna. Journal of Laboratory Diagnostics 2010 • Volume 46 • Number 3 • 293-298. http://www.diagnostykalaboratoryjna.eu/journal/DL_3_2010._str_293-298.pdf

[6].http://dolinabiotechnologiczna.pl/diagnostyka-laboratoryjna-2/farmakologia-w-diagnostyce-czesc-druga-%E2%80%94-wapn-i-magnez/?print=print

[7]. http://www.novazym.ehost.pl/esklep4/calcein-ml-p-398.html

[8]. Smarz-Widelska I., Syroka-Główka M., Książek P., Załuska W., 2006.Hiperkalcemia w wybranych przypadkach klinicznych.  . http://wple.net/nefrologia/nef_numery-2006/a-nefro-1-2006/34-37-smarz-widelska.pdf Nefrologia i Dializoterapia Polska, 10, Nr 1, s. 10-37

[9]. Gellert R., 2011. Hipo- i hiperkalcemia – patogeneza i problemy terapeutyczne. Forum Nefrologiczne 2011, tom 4, nr 4, 373–382. http://czasopisma.viamedica.pl/fn/article/viewFile/18520/14550

[10]. Markiewicz-Zukowska R.,2012. Stężenie wapnia w surowicy krwi osób starszych. BROMAT. CHEM.TOKSYKOL.–XLV,2012,3,str.771–774. http://www.ptfarm.pl/pub/File/Bromatologia/2012/3/771-774.pdf

[11]. Dolińska B., Mikulska A., Ryszka F., 2008. Skuteczność preparatów wapnia w profilaktyce jego niedoborów. Farmaceutyczny Przegląd Naukowy, Nr 7-8/2008. http://fpn.sum.edu.pl/archiwum/cale_numery/78_2008.pdf

[12]. Jakubas-Kwiatkowska W., Błachowicz A., Franek E., 2005. Hipokalcemia w praktyce klinicznej- przyczyny, objawy i leczenie. Kliniczna Interpretacja Wyników Badań. Choroby Serca i Naczyń 2005, tom 2, nr 4, 232–237. Via Medica, 2005.1733-2346.

[13]. http://www.mamz.pl/almanach/skrypty/pokazy/ebook_skladniki_mineral.pdf