Izolowanie fibrynogenu (metoda Blombäck’a, 1956)

Metoda polega na wytrąceniu z osocza tzw. I frakcji Cohna, którą oczyszcza się za pomocą mieszaniny cytrynianowo-etanolowo-gicynowej. Mieszanina ta ma dobrane stężenia w ten sposób, by sprzyjały one rozpuszczaniu się wszystkich składników białkowych poza fibrynogenem [8].

Wykonanie:

Jako materiał do oznaczenia wykorzystuje się osocze, zawieszone w roztworze cytrynianu sodu, które należy doprowadzić do pH=7,2 (za pomocą buforu octanowego). Próbkę oziębić w łaźni z lodem do temp. 0°C, a dalej dodać do niej kroplami (stale mieszając) wychłodzony etanol do końcowego stężenia równego 8% (tj.: 177 ml 53,3 % etanolu na 1000 ml osocza). W trakcie dodawania etanolu należy stopniowo obniżyć temperaturę do -3°C,po czym próbkę osocza pozostawić w tej na 30-60 minut (ciągle delikatnie mieszając).

Frakcję I Cohna (strąt) należy oddzielić przez wirowanie przy 2500 obr./min w temp. -3°C przez 20 minut (z 1 litra osocza uzyskuje się 30-40 g osadu). Otrzymana frakcja zawiera ok. 40-50% białka wykrzepianego trombiną. W kolejnym etapie oczyszczania, do próbki dodaje się  bufor cytrynianowy z etanolem i glicyną (podwójne ekstrahowanie próbki).

Ekstrakcja I: do otrzymanego osadu należy dodać 700 ml zimnego odczynnika tj. 0,055 M bufor cytrynianowy- 6,5% etanol- 1 M glicyna o pH=6,0 (tj.: 16,177 g C₆H₅O₇Na₃∙2H₂O i 75 g glicyny rozpuścić w 800 ml wody, dodać 65 ml absolutnego etanolu, po czym roztwór doprowadzić do pH=6,0 za pomocą stężonego roztworu HCl. Całość uzupełnić wodą do obj. 1000 ml). Otrzymaną zawiesinę należy mieszać przez 1 godzinę (w temp. -3°), a następnie odwirować przy 2500 obr./min, w temp. -3°C przez 20 minut. Supernatant otrzymany po wirowaniu należy usunąć.

Ekstrakcja II: Proces ekstrakcji jest identyczny jak wyżej. Do osadu dodać 700 ml zimnego  odczynnika tj. 0,055 M bufor cytrynianowy- 6,5% etanol- 1 M glicyna (o pH=7,2). Osad należy rozpuścić w 60 ml 0,055 M roztworu cytrynianu sodowego, po czym mieszaninę dializować przez co najmniej 12 godzin (wobec cytrynianu sodowego). Otrzymane nierozpuszczalne części usunąć przez wirowanie (4000 obr./min przez 20 minut). Stężenie otrzymanego fibrynogenu oznaczyć spektrofotometrycznie [8].

Metoda von Claussa (oznaczanie czasu krzepnięcia trombiny) [9].

Zasada metody: trombina obecna w nadmiarze powoduje, że czas krzepnięcia rozcieńczonego osocza jest odwrotnie proporcjonalny do stężenia fibrynogenu osocza. Do oznaczenia przygotowuje się krzywą kalibracyjną, gdzie na osi odciętych zaznacza się wartości otrzymanych rozcieńczeń, a na osi rzędnych odpowiednie czasy krzepnięcia. Na rynku dostępne są gotowe, proste w użyciu zestawy odczynników służące do oznaczania czasu krzepnięcia trombiny, opierające się na powyższej metodzie [9].

Odczynniki:

1) Trombina: liofilizat, w odczynniku obecna jest niewielka ilość kaolinu, dzięki któremu łatwiejsze jest wykrycie krzepnięcia (poprawa właściwości optycznych)

2) Bufor: w skład buforu wchodzi cytrynian, pełniący funkcję antykoagulanta oraz inhibitory fibrynolizy (wykorzystywane do oznaczania krwi włośniczkowej)

Jako materiał badany w metodzie wykorzystywana jest krew żylna, pobierana do probówek zawierających wysuszony odczynnik Wintrobe’a lub płynny roztwór cytrynianu (1 ml cytrynianu trójsodowego 3,8% do 9 ml krwi). Pobraną krew żylną należy wirować przy 2 000 x g/min. przez 10 minut [9].

Wykonanie oznaczenia:

A) Liofilizat: do fiolki (probówki) zawierającej liofilizat należy dodać 2 ml wody dejonizowanej, fiolkę zamknąć, a zawartość rozpuszczać przez delikatnie mieszanie (przez 10 minut). Po wymieszaniu, inkubować fiolkę przez 15 minut, po czym ponownie wymieszać (należy unikać powstawania piany w próbce).

B) Osocze: badane osocze z buforem należy rozcieńczyć w stosunku 1:10

C) Metoda ezy: w łaźni wodnej o temp. 37°C należy ogrzać próbkę trombiny (poczekać do momentu ustabilizowania temperatury), a następnie do rurki hematokrytycznej o objętości 0,2 ml należy pobrać rozcieńczone osocze w celu oznaczenia hematokrytu.  Próbkę inkubować 2 minuty w łaźni wodnej (temp. 37°C), po czym dodać do niej 0,2 ml trombiny. Na tym etapie należy włączyć czasomierz i pobierać ezą (w równych odstępach czasu) próbkę, notując czas krzepnięcia. Prawidłowa wartość powinna mieścić się między 8 – 25 sekund [9].

Obliczenia:

Na podstawie zebranych wyników (uzyskanych różnymi metodami) oznacza się prawidłowe wartości czasu krzepnięcia trombiny. I tak, w przypadku rozcieńczenia próbki w stosunku 1:10, wartość oznaczenia można odczytać z dołączonej do zestawu ulotki. W przypadku zbiórki krwi do próbki z cytrynianem oraz dla normalnego hematokrytu, otrzymany wynik należy zwiększyć o 20% . Prawidłowe wartości powinny mieścić się w granicach 2,5 do 4,0 g/l [9].

Wykreślenie krzywej kalibracyjnej: na podstawie obliczeń należy wykreślić krzywą kalibracyjną, gdzie na osi odciętych nanosi się wartości rozcieńczonego osocza tj.: 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, zaś na osi rzędnych uzyskane czasy krzepnięcia.

W celu oznaczenia stosunku fibrynogenu do osocza należy skorzystać ze wzoru:

Stosunek w g/l =  n x k x Tr,

Gdzie:

Tr- stosunek fibrynogenu do osocza

k- współczynnik stężenia

n- odwrotność uzyskanego rozcieńczenia  [9].

Autor:Lidia Koperwas

Literatura:

[1]. Bajer-Czajkowska A., Nowacki P., Nocoń D., Podbielski J.,2002. Fibrynogen osoczowy a dynamika ostrej fazy udaru niedokrwiennego mózgu. Udar Mózgu 2002, tom 4, nr 2, 47–51. http://czasopisma.viamedica.pl/um/article/view/33769/24811

[2]. http://biotka.mol.uj.edu.pl/zbm/handouts/2013/AgJ/Wyklad_12.pdf

[3]. Ponczek M.B., 2010. Rola domen spokrewnionych z fibrynogenem w różnicowaniu i migracji komórek nowotworowych. Postępy Biologii Komórki, TOM 37 2010 NR 3 (539-552). http://www.pbkom.eu/sites/default/files/artykulydo2012/37_3_539.pdf

[4]. Undas A., Iwaniec T., Zawilska K., 2011. Problemy diagnostyki dysfibrynogenemii i hipofibrynogenemii wrodzonej- charakterystyka genetyczna pierwszych „polskich” fibrynogenów. Acta Haematologica Polonica 2011, 42, Nr 1, str. 31–41. http://pthit.pl/Acta_Haematologica_Polonica,Krwawienie_Dysfibrynogenemia_Hipofibrynogenemia_Fibrynogen_Mutacja_Zakrzepica,576.html

[5]. Ponczek M.B., 2010. Ewolucja układu homeostazy kręgowców. KOSMOS Problemy Nauk Biologicznych, Tom 59 2010, Numer 1-2 (286-287), S.83-90. http://kosmos.icm.edu.pl/PDF/2010/83.pdf

[6]. Muszbek L., Yee V.C., Hevessy Z., 1999. Blood Coagulation Factor XIII: Structure and Function. Thrombosis Research 94 (1999) 271-305. http://www.thrombosisresearch.com/article/S0049-3848%2899%2900023-7/abstract

[7]. Mosesson M.W., 2005. Fibrinogen and fibrin structure and functions. Journal of Thrombosis and Haemostasis. Volume 3, Issue 8, p. 1894-1904, 2005. http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1538-7836.2005.01365.x/full

[8]. Kłyszejko-Stefanowicz L, 2003. Ćwiczenia z biochemii. Wydawnictwo Naukowe PWN, 2003, s.645-648.

[9]. http://chemklin.sum.edu.pl/uploaded/Fibrynogen.pdf, Stamarâ

[10]. Bijak M., Ponczek M.B., Nowak P., 2012. Komórkowa odpowiedź na działanie trombiny. Kosmos Problemy Nauk Biologicznych, Tom 61, Numer 3 (296), S. 445-454, 2012. http://kosmos.icm.edu.pl/PDF/2012/445.pdf

[11]. Para J., Krasiński R., Kostka B., 2006. Pomiar generacji trombiny- problemy metodyczne i znaczenie diagnostyczne. Praca finansowana przez Uniwersytet Medyczny w Łodzi, grant nr 502-13-229. http://diagnostykalaboratoryjna.eu/journal/DL_2006__1;_125-136.pdf

[12]. Stępień E., Plicner D., Branicka A., Stankiewicz E., Pazdan A., Śnieżek-Maciejewska E., Górkiewicz I., Kapelak B., Sadowski J., 2007. Czynniki wpływające na generację trombiny mierzoną jako stężenie kompleksów trombina-antytrombina i metodą automatycznego skalibrowanego trombogramu u chorych z zaawansowaną  chorobą wieńcową. Polskie Archiwum Medycyny Wewnętrznej 2007; 117(7). http://www.pamw.pl/sites/default/files/pamw_07_stepien_pl.pdf