Fibrynogen i trombina jako elementy procesu krzepnięcia krwi

Proces powstawania skrzepu fibrynowego

Skrzep fibrynowy powstaje wskutek szybko postępujących po sobie zdarzeń, które inicjowane są działaniem trombiny na łańcuchy Aα i Bβ fibrynogenu. W procesie tym trombina wiąże się z fibrynogenem w centralnej części cząsteczki. Następnie od końców aminowych łańcuchów (odpowiednio Aα i Bβ fibrynogenu) dochodzi do odszczepienia fibrynopeptydu A (FPA) oraz wolnego odszczepienia fibrynopeptydu B (FPB). W wyniku tej reakcji tworzone są monomery fibryny, które to wykazują zdolność polimeryzacji na drodze niekowalentnych interakcji, zachodzących pomiędzy domenami D i centralnymi domenami E kolejnych monomerów. Proces ten prowadzi do powstania protofibryli oraz grubych włókien (fibryli), otrzymywanych w wyniku tzw. bocznej agregacji. Intensywność procesu bocznego łączenia się ze sobą włókien decyduje o wytrzymałości tworzącego się skrzepu. Oporność skrzepu na plazminę (tj. enzym, którego działanie polega na rozkładzie białek krwi wchodzących w skład skrzepu) zależy głównie od tworzących się kowalencyjnych wiązań krzyżowych,powstają na skutek działania aktywnego czynnika XIII (enzymu transglutaminazy) [4].

Kliniczne znaczenie transglutaminazy (czynnika XIII) potwierdzono w 1960 r. (Duckert i wsp.), kiedy to zauważono, że skrzep osoczowy u pacjentów ze skazą krwotoczną był rozpuszczalny w stężonym roztworze mocznika, sugerując niedobór czynnika stabilizującego fibrynę. Opierając się na tej wiedzy, w 1963 r. Międzynarodowy Komitet Czynników Krzepnięcia Krwi, potwierdził, że czynnik stabilizujący fibrynę jest czynnikiem krzepnięcia krwi, nazywając go czynnikiem XIII [6]. Czynni XIII katalizuje przy obecności jonów Ca²⁺ jeden z ostatnich etapów reakcji w kaskadzie krzepnięcia krwi, tworząc wiązania między cząsteczkami fibryny, w wyniku czego powstaje nierozpuszczalny skrzep [4].

Izolowanie fibrynogenu z plazmy (metoda Doolittle’a i wsp., 1973)

Zasada metody polega na frakcjonowaniu białek osocza w niskiej temperaturze, wykorzystując w tym celu etanol o różnych stężeniach. Końcową frakcję (zawierającą ok. 90% fibrynogenu) poddaje się dodatkowemu oczyszczaniu, wysalając białko siarczanem amonu (26% nasycenia). W ten sposób otrzymuje się preparat o zdolności do krzepnięcia na poziomie od 95% do 98% [8].

Jako materiał do badań wykorzystuje się krew ludzką, bydlęcą lub świńską, wprowadzoną do 3,2% roztworu cytrynianu sodu (w stosunku 9:1).

Wykonanie:

1) Krew zawieszoną w roztworze cytrynianu sodu należy odwirować przy 2500 obr./min przez 30 minut. Otrzymane po wirowaniu (osadzone na dnie probówki) elementy morfologiczne krwi należy odrzucić.

2) Do 1 ml otrzymanej plazmy (ochłodzonej do temperatury 4°C) dodać 215 ml zimnego odczynnika 1 (tj.: 1 obj. 95% etanolu i 1 obj. 0,055 M roztworu cytrynianu sodu (16,177 g C₆H₅O₇Na₃∙2H₂O, rozpuścić i uzupełnić wodą do objętości 1000 ml) o pH=7,0). Ciągle mieszając, doprowadzić próbkę do temperatury -3°C, po czym inkubować ją w tej temperaturze przez kolejne 30 minut.

3) Po upływie czasu inkubacji, próbkę należy odwirować (2500 obr./min, temp. -3°C, przez 20 minut,a dalej do próbki precypitatu dodać 550 ml ochłodzonego odczynnika 2 (tj.: 1 obj. 95% etanolu i 11,5 obj. 0,055 M roztworu cytrynianu sodu, pH=6,4). Całość przenieść do chłodni, mieszać przez 15 minut za pomocą mieszadła elektromagnetycznego, po czym ponownie odwirować (2500 obr./min, w temperaturze 4°C przez 15 minut).

4) Otrzymany po wirowaniu osad rozpuścić w temperaturze pokojowej w 275 ml odczynnika 3 (tj.: 0,055 M roztwór cytrynianu sodu o pH=6,4). Nierozpuszczalną część próbki odwirować (j.w.), po czym usunąć powstały osad.

5) Do supernatantu o temp. 4°C dodać 49 ml zimnego odczynnika 4 (tj.: 1 obj. etanolu absolutnego i 6,6 objętości 0,055 M roztworu cytrynianu sodu, pH=6,4). Mieszając, pozostawić próbkę w temp. 4°C na 15 minut, a następnie ponownie ją odwirować (j.w.).

6) Do otrzymanego po wirowaniu supernatantu dodać (mieszając) 140 ml zimnego odczynnika nr 5 (tj.: 1 obj. etanolu absolutnego i 4 obj. 0,055 M roztworu cytrynianu sodu, pH=6,4).

7) Mieszaninę ponownie ochłodzić (do -3°C) i dalej inkubować w podanej temp. przez 15 minut. Po inkubacji próbkę odwirować (2500 obr./min, w temp. -3°C przez 15 minut), a otrzymany osad rozpuścić w 1000 ml 0,055 M roztworu cytrynianu sodu o pH=6.4. (rozpuszczanie osadu prowadzić w w temp. 4°C przez ok. 12 godzin, wykorzystując w tym celu mieszadło magnetyczne).

8) Otrzymane części nierozpuszczalne należy ponownie odwirować (2500 obr./min, w temp. 4°C przez 15 minut), po czym do otrzymanego supernatantu kroplami dodawać 351 ml zimnego nasyconego roztworu (NH₄)₂SO₄ (do końcowego nasycenia 26%). Po zakończeniu dodawania odczynnika, próbkę należy mieszać jeszcze przez 1 godzinę.

9) Mieszaninę ponownie odwirować (3500 obr./min, temp. 4°C przez 30 minut). Otrzymany po wirowaniu osad rozpuścić w ok. 60 ml 0,055 M roztworu cytrynianu sodu o pH= 6,4.

10) Całą mieszaninę należy dializować w 4°C wobec cytrynianu sodu przez co najmniej 12 godzin, a powstałe nierozpuszczalne części usunąć poprzez wirowanie (przy 4000 obr./min, w temp. 4°C przez 20 minut).

11) Stężenie otrzymanego roztworu fibrynogenu oznaczyć spektrofotometrycznie [8].