Przedłużenie czasu kaolinowo-kefalinowego [8].

W celu odróżnienia niedoborów czynników krzepnięcia od zaburzeń wynikających z obecności krążącego antykoagulantu porównuje się czas krzepnięcia badanego osocza, osocza prawidłowego oraz mieszaniny równych objętości osocza badanego z osoczem prawidłowym po inkubacji w temp. 37⁰C przez 30 minut.  W przypadku, gdy czas krzepnięcia mieszaniny jest przedłużony tak jak czas krzepnięcia osocza badanego wnioskuje się o obecności krążącego antykoagulantu. Z kolei, jeżeli mieszanina ma prawidłowy czas krzepnięcia zakłada się brak krążącego antykoagulantu, a wnioskuje o niedoborze jednego z czynników krzepnięcia.

Przeprowadzanie powyższego oznaczenia- porównania zalecane jest w laboratoryjnej kontroli leczenia heparyną, gdzie należy mieć na uwadze, że terapeutycznemu stężeniu heparyny odpowiada 1,5-2,5 krotne przedłużenie czasu kaolinowo-kefalinowego w porównaniu z wartością otrzymywaną przed leczeniem tym związkiem [8].

Oznaczania APTT w osoczu ubogopłytkowym

APTT określany jest jako czas krzepnięcia osocza po aktywacji czynników krzepnięcia: czynnika XI i XII w obecności stałych stężeń fosfolipidu. Oznaczenie APTT wykonywane jest w osoczu ubogopłytkowym.

Wykonanie:

Do próbki osocza dodaje się roztwór fosfolipidu (np. kefalinę lub fosfatydy pochodzące z soi) wraz z zawiesiną aktywatora wewnątrzpochodnego szlaku krzepnięcia (np.: kaolin, celit, kwas elagowy). Próbkę inkubuje się przez  3–5 minut w temperaturze 37⁰C, a następnie dodaje się chlorek wapnia. Od tego momentu rozpoczyna się mierzyć czas, aż do powstania fibryny. Należy mieć na uwadze, że zakres wartości referencyjnych APTT zależy od kilku czynników, w tym od stosowanych odczynników oraz wykorzystanej aparatury, w której dokonuje się pomiaru czasu krzepnięcia.

Zaleca się, by każde laboratorium diagnostyczne posiadało  własne normy APTT, które są  oddzielnie dla dorosłych i  dzieci (ustalane na podstawie wyników otrzymanych od zdrowych ochotników) [1],[2].

Oznaczanie APTT często przeprowadzane jest jako część serii badań przesiewowych, które obejmują oznaczanie APTT, PT, czas trombinowy oraz oszacowanie stężenia fibrynogenu [2].

Zdjęcie: Schemat oznaczania APTT w osoczu ubogopłytkowym (ang. PPP- Platelet poor plasma), www.practical-hemostasis.com/Screening Tests/aptt.html

Zestawy wykorzystywane do oznaczania APTT różnią się zastosowanym aktywatorem, którym może być kaolin, cellit, krzemionka czy kwas elagowy, jak również stężeniem i składem fosfolipidów użytych w odczynnikach. Co więcej dostępne na rynku zestawy posiadają różną czułość [6]. Większość laboratoriów wykorzystuje automatyczną metodą oznaczania APTT, w której uznaje się, że doszło do wytworzenie się skrzepu,  gdy gęstość optyczna mieszaniny przekroczyła pewien próg (tworzenie się skrzepów powoduje, że mieszanina jest nieprzezroczysta i przechodzi przez nią mniej światła) [2].

Czas kaolinowo-kefalinowy (wg Łopucki S., 1990) [8].

Zasada metody:

Podczas wstępnej inkubacji osocza z zawiesiną kaolinu dochodzi do aktywacji czynników XI i XII. Następnie po dodaniu do próbki fosfolipidu- kefaliny oraz CaCl₂ rozpoczyna się pomiar czasu krzepnięcia osocza. Dzięki opisanemu testowi możliwe jest określenie wewnątrzpochodnego mechanizmu aktywacji protrombiny (z wyłączeniem płytek krwi). Zamiast kaolinu możliwe jest wykorzystanie podczas oznaczenia np. celitu lub kwasu elagowego, które również pełnią funkcję aktywatorów reakcji [8].

Wykonanie oznaczenia:

Do probówki w łaźni wodnej o temp. 37⁰C należy dodać 0,1 ml badanego osocza cytrynianowego wraz z 0,1 ml zawiesiny kaolinu (tj. 0,5 g/100 ml wody) i 0,1 ml roztworu kefaliny (preparat handlowy- przygotowany wg instrukcji). Otrzymaną mieszaninę należy inkubować przez 10 minut, potrząsając probówkę co ok. 15 sekund. Po upływie czasu inkubacji do próbki dodać 0,1 ml chlorku wapniowego (tj. 0,025 M roztwór CaCl₂: rozpuścić  3, 675 g CaCl₂ ∙ 2H₂O, po czym uzupełnić wodą do objętości 1000 ml) jednocześnie włączając stoper. Delikatnie przechylając probówkę należy określić czas pojawienia się w niej skrzepu. Analogiczne oznaczenie wykonuje się do próbki kontrolnej (zawierającej osocze kontrolne tj. zliofilizowane osocze cytrynianowe- preparat handlowy przygotowywany zgodnie z dołączoną instrukcją).

W zastosowanej metodzie prawidłowy czas krzepnięcia osocza waha się między 37-46 s [8].

Zdjęcie: Schemat kaskady krzepnięcia i czynniki wpływające na APTT, http://www.practical-hemostasis.com/Screening%20Tests/aptt.html

Badania mające na celu określenie poziomu APTT wykorzystywane są przede wszystkim do oceny przyczyn pojawiania się niewyjaśnionych krwawień lub skrzepów. Wraz z oceną czasu protrombinowego (PT) test ten wykorzystywany jest do oceny hemostazy- procesu, w którym organizm tworzy skrzepy krwi w celu zatrzymania krwawienia [9].

Autor: Lidia Koperwas - Wojtanowska

Literatura:

[1]. Chojnowski K., Podolak-Dawidziak M., Windyga J., 2010. Diagnostyka przedłużonego czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji (aPTT). Hematologia 2010, tom 1, nr 1, 81–86, Via Medica. http://czasopisma.viamedica.pl/hem/article/viewFile/15769/12488

[2]. http://www.practical-hemostasis.com/Screening%20Tests/aptt.html

[3]. Iwaszko-Simonik A., 2013. Rozprawa doktorska: „Wskaźniki hemostazy w niedrożności jelit u koni”, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu. http://www.dbc.wroc.pl/Content/22656/Iwaszko-Simonik_A_doktor_085_DBC.pdf?handler=pdf

[4]. Żero E., 2007. Interpretacja badań koagulologicznych – błąd czy patologia. Biuletyn Cormay nr 1(14)/2007. http://www.pzcormay.pl/userfiles/file/biuletyn_cormay_14.pdf

[5]. http://medfood.com.pl/wp-content/uploads/2014/09/opis-bada%C5%84-klinicznych.pdf

[6]. Góralczyk T., Janczy R., Iwaniec T., Undas A., 2012. Nieprawidłowości laboratoryjne związane z obecnością przeciwciał antyfosfolipidowych – od przedłużonego czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji po obniżony poziom czynnika VIII: opis przypadku. diagnostyka laboratoryjna

Journal of Laboratory Diagnostics 2012 • Volume 48 • Number 2 • 163-166. http://www.diagnostykalaboratoryjna.eu/journal/DL_2_2012._str_163-166.pdf

[7]. Szutowicz A., Raszei-Szpecht A., 2009. Diagnostyka laboratoryjna. Tom I.Gdański Uniwersytet Medyczny, Zlecenie KW/224/09.Recenzent prof. dr hab.Wiesława Łysiak-Szydłowska, s.199-200.

[8]. Kłyszejko-Stefanowicz L, 2003. Ćwiczenia z biochemii. Wydawnictwo Naukowe PWN, 2003, s.654-655.

[9]. https://labtestsonline.org/understanding/analytes/aptt/tab/test/