Test CTCs  (ang. Circulating  Tumor Cells)

CTCs jest nową, dopiero testowaną metodą diagnozowania i monitorowania rozwoju choroby nowotworowej. Polega ona na wykrywaniu tzw. krążących komórek nowotworowych w próbce krwi. Wykrycie obecności tych komórek we krwi świadczy o ich uwolnieniu się z guza pierwotnego. Co więcej, komórki te mogą doprowadzić do powstania przerzutów za pośrednictwem układu krwionośnego. Przeprowadzone w trakcie testowania metody badania donoszą, że nawet niewielki guz lity zbudowany jest z co najmniej kilku mln komórek nowotworowych. Część z nich przenika do krwi obwodowej, a gdy w krwiobiegu jest ich ok. 5 tys., wtedy możliwe jest ich wykrycie w próbce krwi. W tym celu wykorzystywane są czułe metodami, które potrafią wykryć nawet pojedyncze komórki nowotworowe. Komórki uwalniane są w różnego rodzaju nowotworach, (np. raka jajnika, płuca, prostaty, czy jelita grubego). Co więcej mogą one występować pojedynczo lub w postaci agregatów komórek nowotworowych. Agregaty komórkowe krążąc w zwartej grupie, mają większe szanse przetrwania w nowym dla nich środowisku, jakim są naczynia  krwionośne. Wraz z postępem choroby zwiększa się liczba komórek nowotworowych w krwi obwodowej. Im więcej komórek krąży w krwiobiegu, tym choroba nowotworowa jest bardziej rozwinięta. Liczba krążących komórek spada po zastosowaniu skutecznej terapii tj. po operacji i odpowiednio dobranych leków. Nawrót choroby objawia się zwiększeniem liczby komórek w krążącej krwi obwodowej [3].

Rosnący guz uwalnia od ok. 100 do 300 komórek nowotworowych w ciągu dnia (w przeliczeniu na 1 gram tkanki nowotworowej). Tak, więc ocena liczby komórek nowotworowych we krwi obwodowej jest niezwykle przydatna zarówno w wykrywaniu różnego rodzaju nowotworów, jak również w trakcie monitorowania procesu leczenia [2].

Izolowanie komórek CTCs w próbce krwi (ViewRNA^TM CTC Platform)

Metoda ViewRNA^TM CTC Platform łączy w sobie dwie nowatorskie technologie umożliwiające wykrywanie i scharakteryzowanie krążących komórek nowotworowych (CTCs) oraz innych rzadkich komórek. Aparat oddzielający (ScreenCell®) to innowacyjne urządzenia jednorazowego użytku, które izolują po rozmiarze duże spektrum komórek nowotworowych. Test hybrydyzacyjny ViewRNA pozwala na amplifikację pojedynczych kopii RNA z jednoczesnym wzmacnianiem sygnałów i tłumieniem tła. Razem te dwie technologie zapewniają zaawansowaną i bezproblemową integrację izolacji CTCs i molekularnej charakterystyki komórek do badań translacyjnych [5]. Badania translacyjne przygotowują odkrycia naukowe (dokonane w laboratoriach, klinikach lub bezpośrednio na ludności)do zastosowań klinicznych. Jest to niezwykle ważne dla poprawy zdrowia poprzez zmniejszanie częstości występowania chorób, zachorowalności i śmiertelności [6].

Zdjęcie: http://www.panomics.com/products/rna-in-situ-analysis/ctc-platform/how-it-works

1) Próbka krwi: krew pobierana jest do probówki K2-EDTA (wersenian dipotasowy)

2) Izolowanie CTCs:

- przygotowanie próbki

- docelowa hybrydyzacja

- amplifikacja sygnału

- obróbka i analiza obrazu [5].

Wykrywanie komórek CTCs wymaga wyjątkowo czułych i swoistych metod analitycznych. Identyfikacja komórek w krążeniu, a także ich odróżnienie od komórek krwio­twórczych i prawidłowych komórek nabłonkowych odby­wa się na podstawie fizycznych i biologicznych właściwo­ści. Zazwyczaj wśród analizowanych parametrów wyróżnia się: wielkość, gęstość i ekspresję specyficznych białek [7].

Izolacja nabłonkowych komórek nowotwo­rowych na podstawie ich wielkości

Metoda ta w skrócie znana jako ISET (ang. isolation by size of epithelial tumor cells) pozwala na izolację komórek CTCs większych niż 8 μm. Według dostępnych danych komórki nowotworowe yzują się mniejszą gęstością niż inne komór­ki w krążeniu. Na rynku dostępnych jest wiele komercyjnych metod, które opierają się na izolacji komórek poprzez wirowanie w gradiencie gę­stości (np. Ficoll-Hypaque; Lymphoprep, OncoQuick). Gbłówną wadą wymienionych metod jest brak odpowiedniej czułości, a dodatkowo podczas procesu izolacji dochodzi do utraty wielu ko­mórek CTCs, co wpływa na obniżenie ich jakości [7].

Wśród najczęściej stosowanych metod izolacji i detekcji komórek CTCs wymienia się:

a) Izolację immunomagnetyczną: komórki nowotworowe „wyłapywane” są z krążenia dzięki zastosowaniu specyficznych markerów powierzchniowych. W niektórych z metod wykorzystywana jest negatywna selekcja jednojądrowych komórek z użyciem przeciwciał anty-CD45, w innych pozytywna selekcja oparta na identyfika­cji nabłonkowych markerów komórek guza przez przeciw­ciała monoklonalne. Główną wadą tych metod jest brak automatyzacji powtarzalnych procedur laborato­ryjnych. Z kolei oparcie procesu izolacji jedynie na identyfikacji specyficznych markerów powierzchniowych bardzo często generuje wyniki fałszywie dodat­nie i ujemne [7].

b) Test EPISPOT (ang. EPithelial ImmunoSPOT), który po wyeliminowaniu komórek CD45+, identyfikuje tylko żywe komórki. W technice tej identyfikikacja komórek CTCs opiera się na podstawie wydzielanych lub uwalnianych przez nie białek w cią­gu 48-godzinnej hodowli in vitro. Ograniczeniem testu EPISPOT jest trudność w uzyskaniu dużej liczby komórek oraz ich hodowla in vitro.

c) Metoda mikro­przepływowa CTC-chip- w metodzie tej krew przepływa przez płytkę z mikro­słupkami, które pokryte są przeciwciałami anty-EpCAM. Następnie płytka zawierająca komórki nowotworowe jest wybarwia­na i analizowana z pomocą mikroskopu fluorescencyjne­go. Niestety metoda ta nie jest dostępna komercyjnie [7].

d) CellSearch System CSS- w metodzie tej komórki CTCs wychwytywane są przez kulki magnetyczne, które pokryto przeciwciałem anty-Ep­CAM. Odszukane w próbce komórki nabłonkowe poddawane są znakowaniu za pomocą przeciwciała przeciwko cytokeratynom (CK): 8, 18, 19. Przeciwciało anty-CD45 znakuje limfocyty, zaś jądra komórkowe wybarwiane są za pomocą barwnika fluorescencyjnego (DAPI- 4’,6-diamidy­no-2-fenyloindol). Liczba oznaczonych komórek CK+/DAPI+/CD45− oceniana jest za pomocą czterokolorowego półautomatycz­nego mikroskopu fluorescencyjnego (CellTracks Analyzer II). System CellSearch pozwala na dokładne określenie liczby komórek CTCs w próbce krwi do 72 h od czasu jej pobrania [7].  

Autor: Zuzanna Koperwas

Literatura:

[1]. Barclay R., 2014. Novel Blood Test Can Find One Cancer Cell Among Millions. http://www.healthline.com/health-news/cancer-detecting-blood-test-fastcell-022814#1

[2].http://www.rynekzdrowia.pl/Badania-i-rozwoj/Testowanie-nowej-metody-wykrywania-nowotworow,126067,11.html

[3].http://naukawpolsce.pap.pl/aktualnosci/news,393206,prognozowanie-raka-z-pojedynczej-komorki-nowotworowej-w-probce-krwi.html

[4]. Burke E., 2014. Circulating tumor DNA: A new generation of cancer biomarkers. Genome Advance of the Month. https://www.genome.gov/27556716

[5]. http://www.panomics.com/products/rna-in-situ-analysis/ctc-platform/how-it-works

[6]. http://retinaamd.org.pl/badania-translacyjne/

[7]. Gurtowska N., Bajek A., Olkowska J., Drewa T., 2012. Identyfikacja krążących komórek nowotworowych jako obiecująca metoda diagnostyki chorób nowotworowych układu moczowo-płciowego. Postepy Hig Med Dosw (online), 2012; 66: 983-990
[8]. Nagrath S., et al., 2007. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature 450, 1235-1239 (20 December 2007) | doi:10.1038/nature06385; Received 2 January 2007. http://www.nature.com/nature/journal/v450/n7173/full/nature06385.html