Barwnik urobilinogen u zdrowego człowieka wydalany jest z moczem w śladowych ilościach tj. ok. 4 mg / dobę) [1]. W moczu długo stojącym dochodzi do utlenienia urobilinogenu do urobiliny (pod wpływem światła przez bakterie), co objawia się silną fluorescencją soli cynkowej. Reakcja ta stanowi podstawę wykrywania tego składnika [4].

Zdj. Wzór bilirubiny,  http://www.wbc.poznan.pl/Content/232947/Skrypt%20z%20chemii%20s%C4%85dowej.pdf

Wykrywanie urobilinogenu i urobiliny

Do wykrywania obecności urobilinogenu i urobiliny stosuje się próby Ehrlicha lub Schlesingera.  Nie są to próby swoiste (zwłaszcza próba Ehrlicha jest nieswoista), ponieważ dodatni odczyn Ehrlicha dają również inne związki (np. indol, niektóre leki).

1) Próba Ehrlicha

Urobilinogen w obecności większych stężeń HCl ulega kondensacji z p-dimetyloaminobenzaldehydem do czerwonego związku. Ze względu na fakt, że bilirubina przeszkadza w oznaczeniach, do próbki moczu żółtaczkowego dodaje się 1/5 objętości 10% roztworu CaCl_2, a samo badanie wykonuje się z przesączem. Jako odczynnik wskaźnikowy stosuje się 2% roztwór z p-dimetyloaminobenzaldehydu w 20% roztworze HCl [4].

Wykonanie oznaczenia:

Do 5 ml moczu należy dodać 0,5 ml ww. odczynnika. Pojawienie się czerwonego zabarwienie w próbce na zimno świadczy o zwiększonej ilości urobilinogenu w moczu. Pojawienie się zabarwienia po ogrzaniu próbki świadczy o prawidłowym stężeniu urobilinogenu w próbce, zaś brak czerwonej barwy po ogrzaniu próby- o zmniejszonej ilości lub brak urobilinogenu w moczu. Po wystąpieniu zabarwienia, roztwór badany wytrząsany jest z chloroformem. Barwa powinna przejść do warstwy chloroformowej, jeżeli zabarwienie próbki pochodzi głównie od urobilinogenu [4].

2) Próba Schlesingera

Metoda opiera się na powstawaniu zielonej fluorescencji soli cynkowej urobiliny. Ze względu na to, że bilirubina przeszkadza w oznaczeniu, usuwa się ją z próbki poprzez dodanie BaCl₂ lub CaCl₂, a następnie próbkę alkalizuje się amoniakiem. W wyniku reakcji, dochodzi do wytrącenia się osadu fosforanów (V) wapnia lub baru, który absorbuje bilirubinę. Następnie osad poddaje się przesączeniu. Jako odczynnik wskaźnikowy stosuje się zawiesinę 10 g (CH₃COO)₂Zn w 200 g 90% roztworu etanolu. Przed użyciem mieszaninę należy dokładnie zmieszać.

Wykonanie oznaczenia:

Do badanej próbki moczu należy dodać kilka kropli 1% etanolowego roztworu jodu. Ma to na celu utlenienie ewentualnie obecnego urobilinogenu. Próbkę miesza się następnie z równą objętością odczynnika Schlesingera i poddaje się 1-godzinnej inkubacji. Po godzinie należy próbkę przesączyć. Na ciemnym tle można zaobserwować zieloną fluorescencję przesączu, która znika po dodaniu stężonych roztworów HCl lub H₂SO_4,  jeżeli pochodzi od urobiliny [4].

3) Próba Bogomołowa do wykrywania urobiliny

Do próbki moczu należy dodać niewielką ilość nadtlenku wodoru (albo rozcieńczonego kwasu azotowego), po czym próbkę bardzo energicznie wytrząsnąć (np. w rozdzielaczu) otwierając co kilka sekund zawór, by uwolnić powstały gaz. Utleniony do urobiliny urobilinogen może zostać wykryty w następujący sposób: do 10 ml próbki moczu dodać 0,5 ml stężonego kwasu octowego oraz 0,5 ml 20% roztworu siarczanu miedzi. Próbkę należy energicznie wymieszać, a następnie dodać do niej 1-2 ml chloroformu. W przypadku obecności w próbce urobiliny, dochodzi do zabarwienia warstwy chloroformowej na różowo [1].

Autor: Lidia Koperwas - Wojtanowska

Literatura:

[1]. Jasiewicz B., Kowalczyk I., Kurek J., 2012. Chemia sądowa. Uniwersytet im. Adama Mickiewicza, Wydział Chemii. http://www.wbc.poznan.pl/Content/232947/Skrypt%20z%20chemii%20s%C4%85dowej.pdf

[2]. Kamińska J., Koper O.M., 2015. Badanie ogólne moczu. Biuletyn Informacji Cormay, No 1/31/Wiosna/2015. PZ Cormay SA. http://www.pzcormay.pl/userfiles/file/Biuletyny/TL_wiosna_2015_PL.pdf

[3]. Damianov S., Choroby wątroby i dróg żółciowych. Rozdział 8.

https://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:qubIF8f0DcIJ:https://edraurban.pl/layout_test/book_file/118/patofizjoplogiaDamianov.pdf+&cd=9&hl=pl&ct=clnk&gl=pl&client=firefox-b

[4]. Kłyszejko-Stefanowicz L, 2003. Ćwiczenia z biochemii. Wydawnictwo Naukowe PWN, 2003, s.706-707.