Wszystkie organizmy, które narażone są na działąnie tlenu ( mające z nim styczność) wytworzyły szereg mechanizmó obronnych, dzięki którym chroniona jest ich integralność przed działaniem RFT. Jednym z elementów systemu obronnego jest przystosowanie organizmu pod względem organizacji strukturalnej komórek. Działanie takie umożliwia izolację miejsc, w których zachodzą reakcje z wytwarzaniem wolnych rodników będącymi produktami ubocznymi. W związku z tym bardzo ważną rolę w ochronie przed rodnikami odgrywają różne mechanizmy metaboliczne, które podzielono na kilka grup m.in.:
Ceruloplazmina pochodząca z osocza ludzi, wielbłądów, świń, królików oraz koni i szczurów ma podobną masę cząsteczkową znajdującą się w granicach około 130 kDa, co jest zgodne z obserwacjami przeprowadzonymi przez Youmie Park i wsp. (2009) [10].
Oznaczanie aktywności ceruloplazminy [11].
Substratem w reakcji oznaczania aktywności ceruloplazminy jest p-fenylenodiamina (PPD). W pierwszym etapie reakcji dochodzi do utleniania substratu przez ceruloplazminę, w wyniku czego powstaje kompleks enzym-substrat. Dzięki temu możliwe staje się przeniesienie elektronów z substratu (reduktora) na utleniacz (enzym), w wyniku czego Cu(II) zostaje zredukowane do Cu(I), z kolei z substratu powstaje wolny rodnik.
Zredukowana w ceruloplazminie miedź jest utleniana przez tlen, a powstały z substratu rodnik ulega kolejnym przemianom, które w ostateczności prowadzą do powstania produktu o barwie fioletowej. Tym produktem jest tzw. zasada Bandrowskiego (produkt powstały z trzech cząsteczek substratu) [11].
Wykonanie:
Do probówki z 0,1 ml surowicy (lub osocza krwi) należy wprowadzić 1 ml 0,5% roztworu chlorowodorku p-fenylenodiaminy (PPD), oraz 8 ml buforu octanowego (tj. 0,4 M bufor octanowy o pH=5,5). W tym samym czasie przygotować próbkę stanowiącą kontrolę reakcji, do której należy dodatkowo dodać 1 ml 0,1% roztworu azydku sodu (tj. 0,1% roztwór azydku sodu). Próbki inkubować w temperaturze 37 st.C przez 1 godzinę. Po upływie czasu inkubacji, do próby badanej dodać 1 ml 0,1% roztworu azydku sodu, co spowoduje zatrzymanie reakcji. W przygotowanej próbce oznaczyć wartośc absorbancji wobec próbki kontrolnej przy długości fali λ=530 nm. Aktywność enzymu ceruloplazminy podawana jest w jednostkach Ravina tj. A530 /60 minu lub w jednostkach międzynarodowych U [11].
Choroba Wilsona a ceruloplazmina
Choroba Wilsona zaliczana jest do rzadkich genetycznie uwarunkowanym schorzeń, które dziedziczone są w sposób autosomalny recesywny. Głównym objawem tej choroby jest wystąpienie zaburzeń funkcji wątroby, a także uszkodzenie układu nerwowego. Za wystąpienie objawów chorobowych odpowiedzialne są mutacje w genie ATP7B. Gen ten zlokalizowany jest na chromosomie 13q14.3. Gen ATP7B koduje biosyntezę tzw. ATP-azy (typu P). Jest to białko odpowiedzialne za aktywny transport miedzi w komórkach wątroby. W wyniku powstania defektu genetycznego dochodzi do zaburzenia transport miedzi do aparatu Golgiego , a także jej wbudowywanie do ceruloplazminy. Konsekwencją tego jest upośledzenie wydzielania miedzi wraz z żółcią, co dalej prowadzi do odkładania się miedź nie tylko w wątrobie lecz również w innych narządach (mózgu, rogówce, sercu, nerkach[5].
Wszystkie dotychczas znane procesy patologiczne związane z chorobą Wilsona podzielono na 3 główne etapy.
Etap I:
- na tym etapie dochodzi do gromadzenia się miedzi w obrębie hepatocytów. Bardzo rzadko pojawiają się objawy kliniczne tego stadium, zazwyczaj pacjenci pzrechodzą ten etap bezobjawowo, co dodatkowo utrudnia diagnostykę.
Etap II:
- w dalszym ciągu dochodzi do gromadzenia się miedzi w hepatocytach. Stan ten uniemożliwia detoksykację komórek oraz przechodzenie jonów miedzi do przestrzeni międzykomórkowej. Dochodzi do rozpdu hepatocytów i aseptycznej martwicy.
Etap III:
- miedź nadal jest uwalniana z komórek wątrobowych- przechodzi do krwi w formie niezwiązanej z ceruloplazminą, a dalej odkłada się w innych narządach organizmu [5].
Metody diagnostyczne choroby Wilsona
W trakcie diagnostyki tej choroby wykonuje się oznaczenie:
- ceruloplazminy
- stężenia miedzi w surowicy
- a także dobowego wydalania miedzi z moczem.
W przypadku pojawienia sie choroby powinno dochodzić do obniżenia stężenia ceruloplazminy i miedzi w surowicy, jednakże znane są przypadki, gdzie diagnozowano prawidłowe stężenie ceruloplazminy (ok. 5% pacjentów). Z kolei, stężenie miedzi w surowicy jest najczęściej obniżone, zaś wydalanie miedzi z moczem- podwyższone [5].
Miedź zaliczana jest do pierwiastków śladowych, jest kofaktorem dla wielu różnych enzymów, a także bierze udział w procesach oddychania komórkowego czy odpowiedzi immunologicznej. Białka mające zdolność wiązania metali (określane mianem metylotionin), odpowiedzialne są za procesy, w których bierze udział miedź. Tak więc, regulują one takie procesy jak: wchłanianie, transport jelitowy i wątrobowy wychwyt miedzi. Po etapie wchłonięcia w jelitach, a następnie przejściu do surowicy krwi dochodzi do wiązania jonów miedzi z albuminami. Następnie, w trakcie ok. 2 godzin jony te wbudowywane są do komórek wątroby, gdzie też miedź jest przechowywana bądź łączona z apoceruloplazmin, w konsekwencji czego dochodzi do utworzenia ceruloplazminy. Powstała ceruloplazmina wydzielana jest następnie do osocza krwi. Należy zaznaczyć, że ceruloplazmina jest głównym czynnikiem odpowiedzialnym za transport miedzi z wątroby do innych tkanek organizmu, przez co działa jak donor metalu w tworzeniu enzymów, które są zależne od miedzi [6].
Ilościowe oznaczanie ceruloplazminy w surowicy metodą immunoturbidymetryczną- Ceruloplasmin Calibrator Turbitest AA Wiener lab [7].
(na podstawie broszury pochodzącej ze strony firmy Wiener Laboratorios S.A.I.C , http://www.wiener-lab.com.ar/wiener/catalogo/archivos/12465_ceruloplasmin_turbitest_aa_pl.pdf]).
Na rynku dostępne są gotowe zestawy wykorzystywane do oznaczania ceruloplazminy w osoczu krwi. Synteza ceruloplazminy odbywa się w wątrobie, zaś jej główną rolą jest transport miedzi w osoczu do enzymów zawierających miedź. Obniżony poziom tego enzymu występuje w chorobie Wilsona oraz w chorobach układowych, zaś nabyty deficyt ceruloplazminy może być spowodowany m.in. niewydolnością wątroby. Podwyższony poziom enzymu obserwuje się np. w ostrych i przewlekłych stanach zapalnych czy żółtaczce [7].
W metodzie immunoturbimetrycznej (Wiener Lab) ceruloplazmina reaguje ze specyficznym przeciwciałem prowadząc do utworzenia nierozpuszczalnego kompleksu immunologicznego. Dochodzi do pojawienia się zmętnienia, które jest proporcjonalne do stężenia ceruloplazminy w oznaczanej próbce. Zmętnienie mierzone jest spektrofotometrycznie [7].
W trakcie oznaczenia należy przestrzegać następujących warunków:
- oznaczenie wykonuje się przy długości fali λ= 340 nm
- reakcję należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej 25°C (dopuszczalne są wahania temperatury w granicach 22°C - 30°C)
- czas trwania reakcji: 15 minut
- objętość próbki: 10 µL
- końcowa objętosć mieszaniny reakcyjnej : 1810µL [7].
Zdjęcie: Procedura postępowania podczas Ilościowe oznaczanie ceruloplazminy w surowicy metodą immunoturbidymetryczną- Ceruloplasmin Calibrator Turbitest AA Wiener lab., procedura pochodząc aze strony: http://www.wiener-lab.com.ar/wiener/catalogo/archivos/12465_ceruloplasmin_turbitest_aa_pl.pdf [7].
W warunkach in vitro ceruloplazmina zachowuje się jak enzym, który katalizuje utlenianie dwuwartościowego żela. Już w 1970 roku H. P. Roeser i wsp. przeprowadzili badani wśród osób z chorobą Wilsona, mające na celu zbadanie metabolizmu żelaza w zaburzeniach charakteryzujących się zmniejszonym poziomem ceruloplazminy. Wśród przebadanych pacjentów, dowody świadczące na niedobór żela potwierdzono u 6 z 8 przebadanych osób, z kolei u 5 z 6 osób stwierdzono spadek poziomu ceruloplazminy w osoczu o 5% w stosunku do normy. Badania te już wtedy sugerowały, że niedobór żelaza diagnozuje się najczęściej u pacjentów z chorobą Wilsona, spowodowany prawdopodobnie wadliwym transferem żelaza z komórek błony śluzowej jelita do osocza [8].
Izolowanie ceruloplazminy z osocza krwi świni (M.Hilewicz- Grabska i wsp., 1988: Arch. Biochem. Biophysis., 260: 18-27) [11].
Dzięki wykorzystaniu pewnych charakterystycznych właściwości ceruloplazminy (Cp), możliwe jest jej wyizolowanie z osocza krwi. Ceruloplazmina wiąże się z jonowymieniaczem DEAE-Sephadex A-50 pod wpływem obecności kwasu 6-aminokapronowego (pełniącego rolę inhibitora enzymów proteolitycznych). Następnie, dochodzi do usunięcia albumin za pomocą wysalania siarczanem (VI) amonu i selektywnej denaturacji mieszaniną etanol/chloroform. Do wymiany jonowej z anionitem dochodzi w okreslonych warunkach tj.: w obecności 0,05M buforu fosforanowego o pH=6,82 oraz w roztworze, którego siła jonowa wynosi µ=0,16 [11].
Aniony ceruloplazminy (oraz albumin) ulegają wymianie z anionami jonowymieniacza, a następnie są wiązane na żelu DEAE-Sephadex A-50 za pomoca zdysocjonowanych kationowych grup jonowymieniacza. Zjawisko to zachodzi znacznie łatwiej w przypadku ceruloplazminy i albumin niż u pozostałych globulin.
Elucja ceruloplazminy (Cp) z kolumny:Ceruloplazmina eluuje się z kolumny chromatograficznej przez zastosowanie roztworu o znacznie większej sile jonowej niż pozostałe białka (ceruloplazmina ma najniższą wartość punktu izoelektrycznego). By elucja przebiegała sprawnie zazwyczaj stosuje się roztwory o większej sile jonowej i o niższym pH (5,5), przy którym cząsteczki ceruloplazminy mają znacznie mniejszy ładunek ujemny niż przy pH= 6,82, przez co ich siła związania z jonowymieniaczem jest mniejsza [11].
Oczyszczanie Cp:Na etapie oczyszczania ceruloplazminy bardzo ważne jest pozbycie się albumin. Albuminy mają zbliżoną wartość punktu izoelektrycznego do ceruloplazminy, przez co eluowały by się razem z ceruloplazminą. Wartośc pI dla ceruloplazminy wynosi: 4, 4, zaś dla albumin : 4,9.W trakcie elucji wykorzystuje się fakt, że ceruloplazmina będąca α-globuliną, może być wysolona z roztworu przy zastosowaniu ok. 50% nasycenia siarczanem (VI) amonu. W przypadku albumin, zastosowanie takich warunków wysolenia powoduje, że zostają one nadalw roztworze.
Ostatecznie oczyszczony produkt (ceruloplazminy) uzyskuje się przez selektywną, trwająca 3 godziny denaturację, która prowadzona jest w temperaturze pokojowej. Do denaturacji wykorzystuje się mieszaninę etanol/chloroform (zmieszane w stosunku 9:1). Mieszanina denaturująca dodawana jest następnie do roztworu ceruloplazminy w stosunku 3:1. W takich warunkach denaturacji ceruloplazmina nie ulega denaturacji (w przeciwieństwie do wszystkich pozostałych białek, które znajdują się w roztworze), po czym Cp bardzo łatwo ulega ekstrakcji roztworem NaCl, a co więcej cząsteczka ta wykazuje niezmienioną aktywność enzymatyczną [11].
Dializa roztworu ceruloplazminy:Etap ten ma na celu pozbycie się resztek etanolu oraz chloroformu. Dialize prowadzi się wobec 0,9% NaCl o pH ok. 7. Z kolei, w celu pozbycia się zanieczyszczeń miedzią, która nei jest związana z ceruloplazminą, uzyskany roztwór enzymu przepuszcza się przez kolumnę jonowymieniacza Chelex-100 (o wymiarach 1x 2 cm), z dużą szybkością wypływu [11].
Wiązanie białek na jonowymieniaczu DEAE-Sephadex A-50Jako materiał do badań wykorzystuje się krew świni, która pobrana jest na antykoagulant (w stosunku: 100 ml 1M roztworu cytrynianu , 1M kwas 6-aminokapronowy na 5 ml krwi). Tak otrzymaną próbkę poddaje się wirowaniu przy 3000 obr./min przez 40 minut [11].
Przygotowanie jonowymieniacza:
Odważyć złoża DEAE –Sephadex A-50 i zawiesić je w wodzie (stosując zależność: ok. 1g złoża/ litr osocza). Po kilku godzinach wodę należy zlać (dekantacja) a pozostały osad przemyć na lejku Schotta za pomoca kilku litrów 0,05 M buforu fosforanowego (o pH= 6,82), w celu zrównoważenia żelu [11].
Zazwyczaj do 1 litra 0,5M buforu fosforanowego dodaje się ok. 7 litrów wody oraz 100 ml zawiesiny 1g zelu DEAE-Sephadex A-50, który zrównoważony jest wspomnianym buforem fosforanowym (0,05M) i 20 mililitrami 1M roztworu kwasu 6-aminokapronowego. Całość należy wymieszać, po czym dodać 1 litr osocza – mieszaninę uzupełnić wodą do końcowej objętości równej 10 litrów. W ten sposób uzyskuje się 10 razy rozcieńczone osocze w 005 M buforze fosforanowym. Całość mieszaniny wymieszać na mieszadle magnetycznym przez ok. 2 godziny. Po upływie czasu mieszania, zdekantować płyn, a zawiesinę z zielononiebieskim żelem na lejek Schotta i przemywa 0,05M buforem fosforanowym, aż do momentu gdy wartość absorbancji wycieku przy λ=280 nm dojdzie do A280< 0,05 [11].
Z uzyskanego żelu formuje się kolumnę, którą dodatkowo przemywa się ok. 100 ml 0,05 M buforu,a dalej bardzo ostrożnie na żel nanosi się 0,2 M bufor octanowy ( o pH=5,5) z 0,125 M NaCl i ustala się szybkość wypływu: 1 kropla/ 2 sekundy. W momencie, gdy barwa płynu wyciekającego z kolumny zmieni kolor na błękitną, należy zacząć zbierać wypływające frakcje- będą one zawierały ceruloplazminę [11].
Wysalanie ceruloplazminy za pomocą siarczanu (VI) amonu:Do zbieranej niebieskiej frakcji roztworu ceruloplazminy wkroplić (stale mieszając) 0,4 objętości nasyconego roztworu (NH4)2SO4 będącego w 30% nasyconego siarczanem. Po 15 minutach inkubacji w temperaturze 5 st.C odwirować zawiesinę przy 3000 obr./min. przez 10 minut. Po wirowaniu wytrąca się osad globulin, który automatycznie odrzuca się (nie jest brany do dalszego oznaczenia), zaś do otrzymanego niebieskiego supernatantu należy wkroplić nasycony roztwór (NH4)2SO4 w ilości równej objętości wyjściowego roztworu ceruloplazminy (58% nasycenia siarczanem np. do 50 ml roztworu Cp należy wkroplić najpierw 20 ml siarczanu, a dalej podczas drugiego wysalania kolejne 50 ml siarczanu). Po 30 minutowej inkubacji w 5C próbkę ponownie odwirowuje się (3000 obr./min przez 10 minut). Otrzymany po wirowaniu osad rozpuszcza się w 50 ml 0,2 M buforu octanowego o pH=5.5 z dodatkiem 0,125 M NaCl [11].
Obliczenie objętości osadu białka:Objętość tą oblicza się z różnicy objętości po rozpuszczeniu osadu i objętości dodanego do próbki buforu w następujący sposób: jeżeli osad rozpuszczono np. w 50 ml buforu i uzyskano objętość próbki równą 60 ml, to z obliczeń: 60 ml próbki – 50 ml buforu= 10 ml osadu. Następnie, próbkę uzupełnia się tym samym buforem do końcowej objętości, która będzie równa 10-krotnej objętości osadu ( czyli w przypadku podanego przykładu będzie to 100 ml buforu) [11].
Autor: Lidia KoperwasLiteratura: [2]. Augustyniak A., Skrzydlewska E., 2004. Zdolności antyoksydacyjne w starzejącym się organizmie. Postepy Hig Med Dosw (online), 2004; 58: 194-201. Zakład Chemii Nieorganicznej i Analitycznej Akademii Medycznej w Białymstoku
[3]. Bunker V.W., 1992. Free radicals, antioxidant and ageing. Med. Lab. Sci; 49: 299-312
[4]. Kulbacka J., Saczko J., Chwiłkowska A., 2009. Stres oksydacyjny w procesach uszkodzenia komórek. Pol. Merk. Lek., 2009, XXVII, 157, 44. Akademia Medyczna we Wrocławiu, Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, kierownik: prof. dr hab. A. Gamian
[5]. Tarnawska B., Członkowska A. Choroba Wilsona. VIA MEDICA, ISSN 1734–5251. Oficjalne portale internetowe PTN. Polski Przegląd Neurologiczny, 2008, tom 4, nr 3. www.ppn.viamedica.pl
[6]. Kochanowska I., Hampel-Osipowicz E., Waloszczyk P., 2008. Choroba Menkesa- genetyczny defekt metabolizmu miedzi. Vo l . 1 7 / 2 0 0 8 , n r 3 3. Neurologia dziecięca. Praca poglądowa.
[7]. Linia turbitest AA. Do ilościowego oznaczania ceruloplazminy w surowicy metodą immunoturbidymetryczną, http://www.wiener-lab.com.ar/wiener/catalogo/archivos/12465_ceruloplasmin_turbitest_aa_pl.pdf. Nr kat. 1009357
[8]. Roeser H.P., Lee G.R., Nacht S., Cartwright G.E., 1970. The role of ceruloplasmin in iron metabolism. J Clin Invest. 1970 December; 49(12): 2408–2417. doi: 10.1172/JCI106460
[9].Murray R.K., Granner D.K., Mayes P.A., Rodwell V.W.,1995. BIOCHEMIA HARPERA, Wydanie III, Redaktor naukowy tłumaczenia Franciszek Kokot. Wydawnictwo Lekarskie PZWL. S.776-777, rozdział 58.
[10]. Youmie Park, In Sun Lee, Eun Ji Joo E.J.,Bum-Soo Hahn, Yeong Shik Kim, 2009. A Novel and One-Step Purification of Human Ceruloplasmin by Acharan Sulfate Affinity Chromatography.
[11]. Kłyszejko-Stefanowicz L, 2003. Ćwiczenia z biochemii. Wydawnictwo Naukowe PWN, 2003, s. 531-535.
Ceruloplazmina zaliczana jest do α-globulin, a jej miejscem występowania jest osocze. Ze względu na zawartość miedzi w jej budowie, zabarwienie ceruloplazminy jest niebieskie (zawiera aż 90% miedzi zawartej w osoczu). Ze względu na bardzo mocne wiązanie przez ceruloplazminę atomów miedzi, pierwiastek ten nie jest łatwo wymienialny (każda cząsteczka ceruloplazminy wiąże 6 atomów miedzi). Pozostałe 10% miedzi występujących w osoczu przenoszone jest przez albuminę,jednak siłą wiązania miedzi przez albuminę jest znacznie słabsza niż wiązanie przez ceruloplazminę. Dzięki temu albumina łatwiej oddaje miedź do tkanek, a jej udział w procesie transportu miedzi w organizmie wydaje się być bardziej istotny [9].
Recenzje