Oznaczanie dwóch aminotransferaz tj. aminotransferazy asparaginianowej (AST, GOT-glutamic oxoloacetic transaminase) i alaninowej (ALT, GPT-glutamic pyruvic transferase) jest szeroko stosowane w analityce enzymologicznej.  W komórce aminotransferaza alaninowa zlokalizowana jest w cytoplazmie, z kolei asparaginianowa (AST) w mitochondrium i cytoplazmie. I tak AST ma swój izoenzym mitochondrialny i izoenzym cytoplazmatyczny. Znane są także dwa izoenzymy dla aminotransferazy asparaginianowej tj. ALT1, który kodowany jest przez gen położony na chromosomie 8, oraz ALT2 dla którego gen zlokalizowany jest na chromosomie 16 [1].  Zarówno AST , jak i ALT występują w różnych narządach, poziom ALT w tkankach pozawątrobowych jest niski.

Oznaczanie AST i ALT w diagnostyce klinicznej

Aminotransferazy asparginianowa i alaninowa występują m.in. w komórkach mięśnia serowego czy w komórkach mięśni szkieletowych. Poziom aminotransferazy alaninowej w komórkach mięśniowych jest bardzo niski. Oznaczanie obydwu enzymów ma bardzo duże znaczenie diagnostyczne.  W przypadku uszkodzenia komórek wątroby dochodzi do wzrostu aktywności obydwu enzymów w osoczu w stosunku charakterystycznym dla hepatocytów. Tak więc, wzrost tego  poziomu jest markerem uszkodzenia wątroby [1].  Z kolei, AST ze względu na powszechność występowania, wzrost jego aktywności  obserwowany jest w trakcie uszkodzenia komórek każdego narządu. Bardzo duży wzrost aktywności AST w surowicy obserwuje się w rozległych uszkodzeniach mięśni (przekroczenie górnego zakresu wartości referencyjnych może być nawet 100-krotne). Ponadto, znaczny wzrost AST obserwuje się również w zawale mięśnia sercowego, oraz wspomnianych już ostrych fazach uszkodzeń wątroby. Wzrost aktywność AST w surowicy pociąga za sobą rónież wzrost ALT, jednak ALT wzrasta nieznacznie. Tak więc, stosunek aktywności AST do ALT odpowiada w przybliżeniu stosunkowi obydwu enzymów w komórkach narządu, który to uległ uszkodzeniu. W związku z małą specyficznością narządową, analiza poziomu aktywności aminotransferaz ma ograniczoną użyteczność diagnostyczną [1].

Reitman i Frankel (1957) przedstawili prostą, kolorymetryczną metodę szacowania aktywności aminotransferaz w surowicy wykorzystującą różnice we współczynnikach ekstynkcji alkalicznych roztworów  z 2,4-dinitrofenylo-hydrazyną,  alfa-ketoglutaranem, szczawiooctanem i pirogronianem, umożliwiając tym samym pomiar szybkości reakcji przez oznaczenie szybkości zachodzących zmian absorbancji [3].

Oznaczanie aktywności AST i ALT za pomocą zmodyfikowanej metody Reitmana i Frankela

Aminotransferazy przenoszą grupy aminowe z α-aminokwasów na odpowiednie 2-oksokwasy. Za miarę aktywności tych dwóch enzymów uznaje się ilość powstałych w wyniku reakcji oksokwasów. Oksokwasy oznaczane są jako fenylohydrazony, które to w zasadowym środowisku dają brunatno-czerwone zabarwienie [4].

Jak już wspomniano aminotransferazy (GOT i GPT) są enzymami wstępującymi w organizmie, a ich  najwyższą aktywność obserwuje  się w sercu, wątrobie, mięśniach szkieletowych, nerkach i erytrocytach. W normalnych (prawidłowych) warunkach, aktywność tych enzymów w surowicy jest bardzo  niska lub równa zeru. Wszelkie zmiany w  tkankach powodują w następstwie zwiększenie ich stężenia w surowicy. Ostry zawał mięśnia sercowego, przyczynia się do wysokiego wzrostu poziomu sercowego  AST (GOT). Najwyższe poziomy ALT (GPT) obserwuje się u pacjentów z wirusowym zapaleniem wątroby i chorobami wątroby.

Zasada działania testu (wg procedury Wienerlab ze strony: http://www.wiener-lab.com.ar/wiener/catalogo/archivos/6306_transaminasas200_en.pdf)

Zdjęcie: Procedura wykonywania oznaczenia testem Transaminasas 200 firmy Wienerlab (procedura Wienerlab ze strony: http://www.wiener-lab.com.ar/wiener/catalogo/archivos/6306_transaminasas200_en.pdf)

Oznaczanie aktywności aminotransferazy asparaginianowej

Metoda I:

1) Aktywność enzymatyczną AST można oznaczać z wykorzystaniem 0.1 M buforu fosforanowego (pH=7.5), który dodatkowo zawiera: 0,2 M L-asparaginian, 0,13mM NADH, dehydrogenazę jabłczanową (0,7 jednostek aktywności) oraz badany roztwór enzymu. Reakcję enzymatyczną rozpoczyna się poprzez dodanie do próbki. 10mM 2-oksoglutaranu. Zastosowanie w reakcji L-asparaginianu w dużym nadmiarze w porównaniu do ilości użytego  2-oksoglutaranu powoduje, że zostaje  przesunięta równowaga reakcji transaminacji (w kierunku tworzenia się  L-glutaminianu oraz szczawiooctanu) [6].

Następnie, powstający w reakcji wspomniany już szczawiooctan oznaczany jest przy udziale dehydrogenazy jabłczanowej oraz NADH. Oznaczenie wykonuje się przy λ=340 nm (spadek absorbancji w wyniku utleniania NADH  jest proporcjonalny do aktywności enzymatycznej aminotransferazy AST) [6].

Metoda II:

2) Jako materiał do oznaczenia można wykorzystać np. niedojrzałe nasiona zielonego grochu, z których przygotowuje się analizowaną próbkę, a dokłądniej: 1 g nasion należy rozetrzeć w moździerzu z dodatkiem , stopniowo dodając 1ml 100 mM buforu Tris-HCl (pH=8.0). Następnie, dokładnie rozdrobnioną próbke należy pzrenieść do probówki typu Eppendorf i odwirować przy 15000 obr./min przez 15 minut. Do dalszych oznaczeń aktywności używa się otrzymany po wirowaniu supernatant, rozcieńczony 5x za pomocą buforu Tris-HCl (jak wyżej).

Przygotowanie próbki do pomiaru w kuwecie kwarcowej:

Zmieszać razem 500 µl 100 mM buforu Tris-HCl (pH=8.0) zawierającego 20 mM α-ketoglutaran, 100 µl NADH+H⁺ (tj. 2,5mM roztwór NADH+ H⁺), 100µl dehydrogenazy mleczanowej (o aktywności ok. 1,2jednostki w 100µl – roztwór przygotowany w 100mM buforze Tris-HCl). Na końcu do próbki dodać 100µl ekstraktu tkankowego (otzrymany rozcieńczony supernatant). Kuwete umieścić w spektrofotometrze, po czym nalezy sprawdzić stabilność ukłądu, a dalej zapoczątkować reakcję transaminacji. Reakcję tą zapoczątkowuje się przez dodanie do próbki 200µl 350 mM roztworu alaniny (350 mM roztwór alaniny w 100mM buforze Tris-HCl o pH=8.0). Od tego momentu rozpoczyna się pomiar spadków absorbancji przy długości fali równej λ=340 nm (w czasie ok. 10 minut).

Na podstawie otrzymanych wyników oblicza się średnią wartość zmiany wartośći absorbancj (∆A) przez czas (min) tj. ∆A/min. Następnie,oblicza się aktywność aminotransferazy alaninowej, która wyrażana jest jako ilość nmoli pirogronianu (powstającego w trakcie zachodzenia reakcji enzymatycznej) w ciągu jednej minuty [8].

Sprzężony test Warburga – oznaczanie aktywności AST i ALT [9].

Wykonanie:

Do roztworu roboczego dla AST lub ALT w objętości 2 ml, wcześniej ogrzanego do temp. 37°C, należy dodać 0,2 ml surowicy (surowica bez hemolizy). Próbkę inkubować w 37°C przez 10 minut (inkubację prowadzić w termostatowanej kuwecie).

Po upływie czasu inkubacji do próbki dodać 0,2 ml 2-oksoglutaranu (tj. 0,18 M roztwór 2-oksoglutaranu w 0,11 M roztworze Tris-HCl o pH=7,5). Zmierzyć wartość absorbancji przy λ=340 nm co 1 minutę, przez okres minimum 5 minut. Na podstawie otrzymanych wyników oblicza się zmianę wartości A w ciągu 1 minuty. Aktywność aminotransferaz w U/l oblicza się z zastosowaniem poniższego wzoru:

U/l = ∆A/min  x  2,4 ml  x  1000 ml / 6,22  x  o,2 ml = ∆A / min  x 1929

Gdzie:

6,22 – to minimolowy współczynnik absorbancji dla NADH. Wspólczynnik ten odpowiada stężeniu 1 µmol/ml

2,4 ml – końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej

0,2 ml – objętość surowicy (użytej w doświadczeniu do oznaczenia) [9].

 

Pomiar aktywności ALT w żelu poliakrylamidowym- elektroforeza

Przygotowanie 7,5% żelu rozwijającego: 1,5M bufor Tris-HCl pH=8.8, z dodatkiem 10% mannitolu, oraz  4% żelu zagęszczającego (0,5M bufor Tris-HCl pH=6.8). Elektroforeza produktó prowadzona jest w buforze Tris-glicyna (pH=8.3). Jako znacznik stosuje się błękit bromofenylowy.  Rozdział prowadzony jest tak długo, aż z żelu nie wyjdzie powyższy znacznik [6].

Po rozdziale elektroforetycznym żel barwiony jest metodą Stejskala (1994). Rozdzielony żel poddawany jest 20-minutowej inkubacji w 0,1M buforze Tris o pH=7.5 zawierającym: 5 mM 20oksoglutaran, 0,1M PLP (fosforan pirydoksalu), 0,5M MTT (3-[4,5-dimetyltiazol-2-yl]-2,5-difenyl-tetrazolium bromidyny, 8mM CSA (sulfinylocysteina), 0,1 mM N-metylofenazyli metasulfonian (m-PMS). Przy udziale sulfinylocysteiny zachodzi reakcja transaminacji, w wyniku czego powstaje sulfinylopirogronian. Związek ten ulega następnie rozkładowi do pirogronianu oraz kwasu sulfonowego (jon kwasu sulfonowego).  W dalszej kolejności jon utlenia się przy udziale PMS i MTT. Po zredukowaniu MTT powstaje nierozpuszczalny chromofor koloru ciemno-niebieskiego, który świadczy o występowaniu aktywnej formy ALT [6].

Autor: Lidia Koperwas

Literatura:

[1]. Szutowicz A., Raszei-Szpecht A., 2009. Diagnostyka laboratoryjna. Tom I.Gdański Uniwersytet Medyczny, Zlecenie KW/224/09.Recenzent prof. dr hab.Wiesława Łysiak-Szydłowska, s. 57, 61-62

[2]. Kędziorek M.E., Zagdańska B.M., 2011. Aminotransferaza alaninowa w roślinach wyższych. Postępy Biologii Komórki Tom 38 2011 NR 3, (533-544). http://www.pbkom.pl/pbkom/roczniki/pdf2011/pbk%2011-3/s533-544.pdf

[3]. Reitman S., Frankel S., 1957. A colorimetric method for the determination of serum glutamic oxalacetic and glutamic pyruvic transaminases. Amer. J. Clin. Pathol. 28: 56-63, 1957. http://garfield.library.upenn.edu/classics1979/A1979HZ21900001.pdf

[4]. http://biblioteka.gumed.edu.pl/admin/ckfinder/userfiles/files/pdf/skrypt.pdf

[5]. Procedura oznaczania aminotransferaz za pomoca testu Transaminasas 200 firmy Wienerlab, procedura ze strony http://www.wienerlab.com.ar/wiener/catalogo/archivos/6306_transaminasas200_en.pdf

[6]. Maciąga M., 2002. ANALIZA ZYMOGRAMÓW  AMINOTRANSFERAZY ASPARAGINIANOWEJ  U TRAW Z RODZAJÓW  TRITICUM I  AEGILOPS. Praca magisterska, SGGW, Warszawa 2002. Pod keirunkiem Prof. Dr hab. A.Paszkowskiego . http://d-artagnan.x10.mx/nauka/pracamag.pdf

[7]. Liu L, Zhong S, Yang R, Hu H, Yu D, Zhu D, Hua Z, Shuldiner AR, Goldstein R, Reagan WJ, Gong DW, 2008. Expression, purification, and initial characterization of human alanine aminotransferase (ALT) isoenzyme 1 and 2 in High-five insect cells.

[8]. http://www.biol.umk.pl/zaklady/dydakt_biochem/biol_ros_5.pdf

[9]. Kłyszejko-Stefanowicz L, 2003. Ćwiczenia z biochemii. Wydawnictwo Naukowe PWN, 2003, s.552-554.