Mikroorganizmy, zamieszkujące niemalże wszystkie miejsca na świecie, stanowią istotny element ziemskiego ekosystemu. Dotychczasowa wiedza o świecie bakterii ogranicza się do takich gatunków, które umiemy hodować w laboratoriach. Duży postęp w badaniach mikroorganizmów, w tym odkrycia w dziedzinie biologii molekularnej i genetyki, dokonano opierając się o czyste kultury drobnoustrojów izolowanych z różnych środowisk na­turalnych. Ostatnie dziesięć lat świadczy o dynamicznym postępie w dziedzinie genomiki i proteomiki bakterii. Do­tychczas poznano pełną sekwencje genomów kilkuset szczepów i gatunków mikroorganizmów. Ocenia się, że 90% tych baz danych to bakterie należące do domeny Bacteria, z czego 75% wiadomości dotyczy bakterii chorobotwórczych. Z pewnością należy także stwierdzić, że bakterie zdolne do wzrostu w warunkach laboratoryjnych (ho­dowlane) stanowią ponad 1% bardzo zróżnicowanej populacji wszystkich gatunków żyjących w różnych środowiskach naturalnych, takich jak na przykład woda, gleba, ścieki, przewody pokarmowe ludzi i zwierząt. Daje to przeświadczenie jak mała jest nasza wiedza o bakteriach. Prace Pace'a oraz jego współpracowników z lat 1985-1986 ukazały  możliwość bezpośredniego izolowania z bakterii środowiskowych podjednostki 5S oraz Igg rRNA. Po raz pierwszy na identyfikację nieznanych dotychczas gatunków bakterii, pozwoliło katalogowanie i sekwencjonowanie tak sklonowanych podjednostek bezpośrednio z bakterii środowiskowych, bez wcześniejszej hodowli. Przełom ten świadczył o możliwości  badania i identyfi­kacji niehodowanych mikroorganizmów środowiskowych. Sprzyjający tej strategii rozwój tech­nik pozwalających na amplifikację DNA (PCR), konstrukcję bogatych bi­bliotek genomowych i szybkie sekwencjonowanie DNA, przyczynił się do zdolności  identyfikowania nieznanych dotąd gatunków i rodzajów bakterii środowi­skowych na podstawie analizy sekwencji 16S rRNA. Od czasów Carla Woesego tworzone drzewo filo­genetyczne bakterii, w oparciu o 16S rRNA, w ostatnich latach szybko się rozwija i wzbogaca o coraz większą liczbę niepoznanych dotądrodzajów, typów, a także gatunków bakterii środowiskowych [1].

W ostatnich latach pokaźnie poszerzono strategię badań niehodowlanych bakterii poprzez klonowanie DNA, które  bezpośrednio pozyskiwano ze środowisk naturalnych, jak i sekwencjonowanie nadzwyczaj dużych środowisko­wych bibliotek genomowych bakterii pochodzących z gleb, wód, ścieków, osadów sedymenta­cyjnych oraz przewodów pokarmowych zwierząt i ludzi. Ten kierunek współczesnej genomiki definiuje się pojęciami: metagenomika, genomika populacji drobnoustrojów bądź genomika mikroorganizmów środowisko­wych. Wyłaniający się nowatorski  kierunek mikrobiologii - metagenomika, zrewolucjonizuje postrzeganie i rozumienie świata mikrobiologii i daje  niezwykle obiecujące rezultaty. Celem naukowców jest dążenie do rozszyfrowania bogactwa infor­macji genetycznej znajdującej się w ogromnych metagenomach, dla określonych środowisk. Istotne znaczenie ma także identyfikacja dotychczas niepoznanych genów, co pozwoliłoby na  zwiększenie wiedzy o niehodowlanych dotąd bakteriach i ich roli w środowiskach naturalnych. Oczekuje się, że da to pożądane re­zultaty w rozwiązaniach biotechnologicznych, które dotyczyć będą produkcji nowatorskich leków, enzymów oraz innych bioproduktów [1].

Geneza metagenomiki 

Po raz pierwszy w 1985 roku Pace i współpracowni­cy przedstawili nową strategię identyfikacji mikroorganizmów, niezależną od wcześniejszej hodowli, która polegała na sekwencjonowaniu podjednostek 5S i 16S rRNA, izolowanych bezpośrednio z próbek środowiska. Ten nowatorski projekt zdecydowanie zaburzył wcześniejsze dokonania Woese i współpracowników, którzy przeprowadzając badania  na czystych kulturach różnych bakterii hodowalnych udowodnili, że sekwencje genów 5S i 16S rRNA są molekularnymi wyznacz­nikami ich filogenezy. Nie ma wątpliwości, że na podstawie wyników wielu prac, w oparciu o szczegółową analizę tych podjednostek na poziomie sekwencji nukleotydowych, można identyfikować poszczególne gatunki i rodzaje, jak również konstruować naturalne drzewo filoge­netyczne bakterii. Istotnego odkrycia dokonano w latach 1991-1998, kiedy opracowano metody umożliwiające klo­nowanie DNA bakterii izolowanych bezpośrednio z różnych próbek środowisko­wych. Stało się też możliwe konstruowanie w różnych wektorach dużych bibliotek fragmentów DNA, oraz wraz z momentem wprowadzenia techniki PCR, amplifikacja całych genów rRNA bądź ich poszczególnych regionów [2].

Strategia badań, nie zależna od hodowli, w dość krótkim czasie pozwoliła na identyfikację w różnych naturalnych środowiskach ogromnej liczby niepoznanych dotąd gatunków, rodzajów oraz typów bakterii.  Natomiast zidentyfikowanie pełnej sekwencji genów 5S oraz 16S rRNA różnych gatunków bakterii środowiskowych dało możliwość konstruowania gatunkowo-specyficznych sond DNA oraz ich znakowanie różnymi wyznacznikami fluorescencyjnymi. Takie sondy zastosowano w mikroskopowej analizie próbek środowisko­wych, której celem była szczegółowa ocena rozlokowania różnych gatunków w określonych środowiskach [3].

W ostatnich latach obserwuje się wzrost liczby badań sekwencji nukleotydowej podjednostki 16S rRNA w populacjach bakterii środowiskowych. Światowa baza danych Gen- Bank do końca 2004 roku mieściła 21466 sekwencji genów 16S rRNA bakterii hodowlanych oraz 54665 sekwencji tych genów z bakterii niehodowlanych. W tym samym roku system ten obejmował aż 14 dodatkowych typów rozpoznanych spośród bakterii hodowlanych i 26 nowych typów bakterii niehodowlanych. Dane te wykazują, że badania obecności i rozprzestrzeniania bakterii w różnych środowiskach naturalnych stały się dostępne, chociaż nie umiemy stworzyć odpowiednich warunków hodowli dla około połowy świata orga­nizmów prokariotycznych Bacteria i Archea [4].

W 1991 roku zrealizowano koncepcję klonowania bakteryjnego DNA izolowanego bezpośrednio z pró­bek środowiskowych. Jako pierwsi Schmidt i współpracownicy sklonowali w wektorze fagowym mieszaninę bakteryjnych DNA izolowanych bezpośrednio z próbek wody morskiej. Był to sposób na skonstruowanie pierwszej środowiskowej biblioteki DNA [3]. Kolejnym sukcesem, okazało się w 1995 roku sklonowanie DNA izolowanego z mieszaniny mikroorganizmów termofil­nych, które były hodowane w laboratorium na wysuszonej trawie (Iignocelulozie). W wyniku tego badania skonstruowano dużą bibliotekę DNA, jak również wyselekcjonowano z niej klony eksprymujące wysoką aktywność celulolityczną. Natomiast, w laboratorium DeLonga w 1996 roku scharakteryzowano kon­strukcję ogromnej biblioteki środowiskowej DNA organizmów prokariotycznych zbiornika słodkowodnego. Wyselekcjonowano tam klon o wielkości 40 kb, a następnie zidentyfikowano jego fragment genomu. Końcem lat 90. w wielu laboratoriach osiągnięto sukces związany z kon­struowaniem w różnych wektorach biblioteki DNA mikroorganizmów z różnych próbek gleby [5].

Szybki rozwój metagenomiki nastąpił w ostatnich 4-6 latach, ponieważ w tym czasie stworzono i opisano wiele bibliotek DNA mikroorganiz­mów gleb, wód słodkowodnych i oce­anicznych, osadów sedymentacyjnych, ścieków, środowisk ekstremalnych (w tym termofilnych i acidofilnych), flory jamy ustnej i przewodu pokarmowego człowieka, flory szpitali, populacji bak­terii tworzących biofilmy oraz bakterii symbiotycznych [6]. W 2004 roku przyjęto pracę Ventera i współ­pracowników, w której opisano konstrukcję metagenomu o wielkości miliarda par zasad mikroorganizmów z Morza Sargassowego na Ber­mudach jak i rozszyfrowanie ich sekwencji nukleotydowych. Obecnie jest to największy zrealizowany projekt w dziedzinie meta­genomiki. Stworzenie olbrzymiej, metagenomowej biblioteki DNA mikroorganizmów morskich, w której zsekwencjonowano po­nad miliard par zasad oraz rozpoznano około 1,2 miliona dotychczas nieznanych genów, dało nowe możliwości wielokierunkowych badań po­znawczych i aplikacyjnych bakterii morskich [7].

W ostatnich latach przeprowadzono badania w dziedzinie metagenomiki również w niewiele poznanym świecie bakteriofagów. Wiedza o nich ogranicza się do tych, których gospodarzami są bakterie hodowlane. Jednak nie za duża jest nasza wiedza o bakteriofagach poruszających się w świecie bakterii nie­hodowlanych. Aktualnie nie wykryto molekularnego wyznacznika, przydat­nego do identyfikacji, taksonomii oraz filogenezy bakteriofagów. Metagenomika dała możliwości konstrukcji banków DNA bakteriofagów niehodo­wlanych bakterii, umożliwiając ich analizę na poziomie sekwencji nukleotydowej. Istotnym nowatorskim osiągnięciem w tej dzie­dzinie jest sklonowanie banku DNA fagów przebywających w przewodzie po­karmowym człowieka.  Naukowcy stworzyli metagenomową bibliotekę DNA fagów, w której poznano ponad 400 różnych fagów, jednak około 60% to nieznane dotąd  bakterio­fagi. Zakłada się, że w organizmie człowieka przebywa około 1200 różnych fagów, które modyfikując genotypy flory bakteryjnej człowieka, niewątpliwie zwiększają jej różnorodność jak i zmienność [6].

Metagenomika

Metagenomika, zwana także genomiką populacji mikroorganizmów środowiskowych i ekogenomiką, jest nową techniką badań. Polega ona na klonowaniu DNA pozyskiwanego bezpośrednio z naturalnych środowisk a następnie sekwencjonowaniu ogromnych bibliotek genomowych, jak i funkcjonalnej analizie materiału ekologicznego izolowanego z różnych nisz ekologicznych [8].

Metagenomika obejmuje następujące etapy prac eksperymentalnych:

• Izolację DNA mikroorganizmów bezpośrednio z próbek środowiskowych. Próbka jest pobierana z naturalnego środowiska flory bakteryjnej i zawiera różne typy mikroorganizmów.
• Otwieranie komórek bakteryjnych przy pomocy metod chemicznych, na przykład silnie zasadowe środowisko, bądź za pomocą metod fizycznych, na przykład sonifikacja.
• Klonowaniein vitrofragmentów restrykcyjnych w odpowiednich wektorach plazmidowych.
• Transformację rekombinowanych klonów do komórek, najczęściejEscherichiacoli.
• Konstrukcję biblioteki klonów, analizę genetyczną i funkcjonalnąbiblioteki oraz selekcję klonów o określonych genotypach bądź właściwościach biologicznych [8].

W metagenomice najczęściej praktykowanymi wektorami do klonowania DNA i konstrukcji bibliotek jest niskokopijny plazmid BAC (bacterial artificial chromosome) oraz fasmidy, ponieważ w wektory te jest możliwość klonowania dużych fragmentów DNA (40-100 kb). W związku z tym uzyskuje się ich stabilną replikację w komórkach gospodarza - biorcy, najczęściej są to komórki odpowiednich szczepów E. coli. Poza tym fasmidy, a przede wszystkim pochodne plazmidu BAC, jako wektory wahadłowe (shuttle BACs) stwarzają możliwość koniugacyjnego przenoszenia DNA z E. coli do innego gospodarza na przykład Streptomyces lividans, bądź Pseudomonans putida. W sytuacji kiedy celem prowadzonych badań jest selekcja klonów zdolnych do ekspresji danych białek, enzymów lub innych bioproduktów, wówczas jest zalecane przenoszenie biblioteki klonów z  E. coli do w/w wymienionych gospodarzy. Dotychczas w analizie metagenomowvch bibliotek DNA, poważne trudności metodyczne stwarza niewielka częstość pojawiania się określonych klonów, głównie klonów o poszukiwanych aktywnościach biologicznych. W tym celu oferuje się różne działania oraz zabiegi. Jedną z metod jest wzbogacenie próbek środowiskowych, z których izoluje się DNA do klonowania, w mikroorganizmy o poszukiwanych właściwościach biolo­gicznych. Kolejnym sposobem jest wzbogacanie klonowanej mieszaniny DNA izolowanej z próbek środowiskowych we frakcje, mogące zawierać ocze­kiwane sekwencje bądź poszukiwane geny [8].

Przykładem wykorzystania naturalnego wzbogacenia danego środowiska w populacje określonych mikroorganiz­mów było skonstruowanie w fasmidzie biblioteki DNA izolowanego z populacji symbiotycznych bakterii gąbek morskich, jej zsekwencjonowanie, a w rezultacie ustalenie pełnej sekwencji nukleotydowej genomu kolejnego gatunku niehodowlanych archebakterii Cenarcha- reum symoiosum. Jednak uwagę należy zwrócić, że w organizmie gąbek mamy do czynienia z populacją tylko kilku gatunków, wśród których gatunek C. symbiosum stanowi około 65%. W ostatnich latach sklonowano i zsekwencjonowano metagenom bakterii, które tworzyły biofilm w kwaśnych wodach kopalni pirytu w Richmond w USA, o temperaturze 42°C i pH 0,1-0,4 oraz 2 mM stężeniu jonów żelaza, miedzi, cynku i arsenu. W warunkach laboratoryjnych biofilm ten jest zdominowany przez populacje kilku rodzajów niehodowlanych bakte­rii: Sufobacillus, Leptospirillum, Acidomicrobium oraz przez archaebakterie Ferroplasma acidarmanus. Dzięki poznaniu sekwencji nukleotydowej całego metagenomu biofilmu o wielkości 72 milionów par zasad, jak również analizie bioinformatycznej stało się możliwe ustalenie pełnej sekwencji nukleotydowej genomów Leptospirillum oraz Ferroplasma, jak i zlokalizowanie w nich istotnych genów odpowiadających za metabolizm i wzrost bakterii biofilmu w tak ekstremalnym środowisku, gdzie jedynym dostępnym źródłem węgla jest C0₂, a źródłem azotu jest azotatmosferyczny. Powyższe przykłady badań miały związek z metagenomami mie­szanych populacji bakterii o dominacji jednego bądź kilku gatun­ków, co ułatwiało sklonowanie takich metagenomów i ich analizę sekwencyjną. Zdecydowanie bardziej skomplikowane jest klonowanie i analizowanie metagenomów złożonych populacji mikroorganizmów wód, a przede wszystkim gleby. Ze względu na liczbę komórek prokariontów w przeliczeniu na 1 gram ma możliwość osiągnięcia wartości 1 miliarda, a nawet więcej, co oznacza, że może w nich przebywać nawet 1000 różnych szczepów i gatunków bakterii.  W związku z tym wykonuje się różne zabiegi, których celem jest wzbogacenie analizowa­nych próbek gleby w populacje bakterii, wyróżniające się pożądaną lub oczekiwaną aktywnością biologiczną. Podej­mowanymi kierunkami działania są próby frakcjonowania izolowanych DNA z tak złożonych populacji mikroorganizmów, aby w zależności od celu badań, do klonowania bibliotek metagenomowych używać określonych, wyselekcjonowa­nych frakcji DNA. Jeden z takich sposobów polega na ultrawirowaniu DNA izolowanego z gleby, zamierzeniem czego jest  separacja do klonowania frakcji bogatych w pary GC. Mikroorganizmy z genomem zasobnym w pary GC, są  organizmami środowiskowymi mającymi  istotne zna­czenie dla biotechnologii leków i ekologii (Actinomyces, Streptomyces, Acidobacteria). Stanowią więc zainteresowanie w badaniach w dziedzinie metagenomiki, których celem jest selekcja z bibliotek metagenomowych klonów o no­wych aktywnościach. Ciekawą strategię stanowi wzbogacenie analizowanych próbek gleby, przed izola­cją z nich DNA, w populacje mikroorganizmów o poszukiwanych aktyw­nościach metabolicznych. Do takich próbek dodawany jest bromodeoksyuracyl (BRdU), który włącza się tylko do DNA aktywnie dzielących się ko­mórek. Za pomocą metody immunoprecypitacji frakcje tak wyznakowanego DNA mogą być bez trudu od­dzielane i używane do konstrukcji bibliotek metagenomowych. W przypadku dodania do próbek gleby określonego substratu będącym źródłem węgla i energii na przykład skrobi, celulozy czy ksenobiotyku, można się spodziewać, że analizowana próbka gleby będzie wzbogacona w populacje mikroorganizmów metabolicznie aktywnych, mających zdolność wykorzystania określonego substratu bądź substratów. Inną metodą jest dodawanie do próbek gleby substratów znako­wanych radioaktywnym węglem bądź azotem. Zdolne do rozkładu określonego, znakowanego radioaktywnie substratu populacje bakterii powiększą swoją gęstość w analizowanej próbce, również genomowy DNA z nich izolowany będzie radioaktywny, a więc łatwy do separacji metodą ultrawirowania w gradiencie. Frakcja tak otrzymanego DNA może być badana za pomocą metody PCR na obecność określo­nych genów bądź klonowana, w celu konstrukcji biblioteki klonów oraz ich analizy funkcjonalnej. W środowisku różnych ksenobiotyków, na przykład chlorofenoli i fenoli, biodegradacja następuje zazwyczaj przy udziale dwóch, a nawet kilku różnych gatunków bakterii. Identyfikacja w środowisku takiej populacji, sklonowanie ich metagenomu, a także identyfikacja genów i ich produktów stanowi szczególne zainteresowanie naukowców. Osiągnięcie sukcesu, jest możliwe dzięki zwiększaniu gęstości komórek populacji poprzez dodawanie wymienionych substratów do analizowanej gleby oraz inkubację próbek przed izolacją DNA [7].

W ba­daniach w dziedzinie metagenomiki należy wyróżnić trzy zasadnicze cele. Mianowicie wnikliwe poznanie  filogenetycznej i taksonomicznej różnorodności mikroorganizmów w biosferze, gdzie większość stanowią dotychczas nieznane, niehodowlane gatunki i rodzaje bakterii. Kolejnym celem jest identyfikacja w konstruowanych metagenomach nieznanych dotąd sekwencji, operonów i genów kodujących nowatorskie leki, białka, enzymy oraz inne bioprodukty mające biotechnolo­giczne znaczenie. Tak więc techniki oraz sposoby stosowane w analizie genetycznej i funkcjonalnej mniejszych i większych bibliotek DNA organizmów środo­wiskowych, jak również ogromnych metagenomów o wielkości milionów par za­sad, zależne są od celu, dla którego zostały skonstruowane. Niezwykle przydatna okazała się metoda PCR, poprzez zastosowanie odpowiednich starterów oraz sekwencjonowanie wyselek­cjonowanych klonów i całych bibliotek metagenomowych. Metoda ta ma również duże znaczenie w analizie bibliotek metagenomowych, a w szczególności w poszukiwaniu sekwencji i genów bakterii niehodowlanych, któ­rych homologi, o ustalonej sekwencji nukleotydowej, są znane w geno­mach bakterii hodowlanych [9]. Dzięki metodom amplifikacji i sekwencjonowania DNA, powiodło się zidentyfikowanie w metagenomowych bibliote­kach także genów odpowiedzialnych za ekspresję nowych syntaz poliketydowych (PKSs), będących zasadniczymi enzymami szlaków biosyn­tezy wielu antybiotyków. Udało się również rozpoznać gen kodujący syntezę rodopsyny, fotoreceptora poznanego najpierw u archebakterii, a następnie zidentyfikowanego w metagenomie bak­terii morskich na fragmencie DNA klona noszącego podjednostkę 16S rRNAProteobacteria. Dowiedziono, że fototrofia jest pokaźnie rozpowszechniona wśródProteobacteria mórz i oceanów, a nie jak sądzono, że jest właściwością tylko gatunków należących dokrólestwaArchea [10].

Znaczenie metagenomiki w identyfikacji nowych genów

7.Venter J.C., Remington K, Heidelberg J.F., Halpern A.L., Rusch D., Eisen J.A., Wu D., Paulsen I., Nelson K.E., Nelson W., Fouts D.E., Levy S., Knap A.H., Lomas M.W., Nealson K., White O., Peterson J., Hoffinan J., Parson R., Baden-Tilson H., Pfannkoch C., Rogers Y.H., Smith H.O. Enviromental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea, Science. 2004. 304, 66-74.

8.Schloss P.D., Handelsman J. Biotechnological prospects from metagenomics, Curr. Opin. Biotechnol. 2003. 14, 303-310.

9.Handelsman J. Metagenomics: Application of genomics to uncultured microor­ganisms, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2004. 68, 669-685.

10.   Beja O., Spudich E.N., Spudich J.L., Leclerc M., DeLong E.F. Proteorhodopsin phototrophy in the ocean,Nature. 2001.411, 786-789.

11.   August P.R., Grossman T.H., Minor C., Draper M.P., MacNeil I.A., Pemberton J.M., Call K.M., Holt D., Osburne M.S. Sequence analysis and functional characteri­zation of the violacein biosynthetic pathway from Chromobacterium violaceum, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2000. 2, 513-519.

12.   Majernik A., Gottschalk G., Daniel R. Screening of enviromental DNAlibriares for the    presence of genes conferring Na⁺(Li⁺)/H⁺ antiporter activity on Escherichia coli- characterization of the recovered genes and the corresponding gene products, J- Bacteriol. 2001. 183, 6645-6653.

13.   Diaz-Torres M.L., McNab R., Spratt D.A., Villedieu A., Hunt N., Wilson M., Mullany P. Novel tetracycline resistance determinant from the oral metagenome, Antimicrob. Agents Chemother. 2003. 47,1430-1432.

14.   MacNeil I.A., Tiong C.L., Minor C., August P.R., Grossman T.H., Loiacono K.A., Lynch B.A., Phillips T., Narula S., Sundaramoorthi R., Tyler A., Aldredge T., Long H., Gilman M., Holt D., Osburne M.S. Expression and isolation of antimicrobial small molecules from soil DNA libraries, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2001. 3, 301-308.

15.   Goh E.B., Yim G., Tsui W., McClure J., Surette M.G., Davies J. Transcriptional modulation of bacterial gene expression by subinhibitory concentration of antibiotics, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. 99, 17025-17030.

16.   http://www.pressebox.com/pressrelease/imgm-laboratories-gmbh/IMGM-Laboratories-First-Service-Provider-to-adopt-Roche-454-GS-FLX-technology-to-offer-advanced-amplicon-based-Metagenomics-Services/boxid/567689