Wykonanie oznaczenia:

1) Do 2 ml badanej surowicy dodać 5 ml roztworu o-fenantroliny w buforze octanowym o pH=4,4 (tj.:9,594 g CH₃COOH∙3H₂O, 1,68 ml lodowatego CH₃COOH, 0,2 g chlorowodorku  hydroksylaminy oraz 0,15 g o-fenantroliny należy dokładnie rozpuścić, po czym uzupełnić wodą do objętości 200 ml), wymieszać i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 5 minut. Próbkę wyjąć, ochłodzić w strumieniu zimnej wody, a następnie dodać 1 ml CCl₄. Całość wytrząsać prze ok. 1 minutę do momentu rozbicia skrzepu skoagulowanego białka. Próbkę odwirować (3000 obr./min, 20 minut). Zlać klarowny supernatant, w którym oznaczyć wartość absorbancji wobec próby kontrolnej (przy długości fali równej λ= 512 nm). Oznaczenie wykonywać w kuwetach o możliwie największej grubości warstwy [1].

2) Oznaczenie dla próby kontrolnej i wzorcowej wykonywane jest w identyczny sposób jak opisany wyżej, przy czym zamiast 2 ml surowicy do próbek dodaje się 2 ml wody lub roztworów wzorcowych (o określonych stężeniach). Na podstawie otrzymanych wyników wykreśla się krzywą kalibracyjną (bez dodawania CCl₄ i bez wirowania).

Stężenie żelaza w próbkach odczytać z wykreślonej krzywej kalibracyjnej lub obliczyć ze wzoru:

µg/100 ml= (A_{(roztworu badanego)} / A_(wzorca)) x c_(wzorca) [µg/100 ml] _[1]

Hepcydyna

Główną rolę w regulacji me­tabolizmu żelaza pełni hepcydyna.  Jest to peptyd o właściwościach bakteriobójczych i przeciwgrzybiczych, którego nazwa odzwierciedla główne miejsce jego syntezy i właściwości bakteriobójcze [7]. U ludzi hepcydyna kodowana jest przez gen HAMP (o dłu­gości 2,5 kb, znajdujący się na ramieniu długim chromosomu 19). Ekspresja mRNA hepcydyny odbywa się przede wszystkim w hepatocytach, aczkolwiek peptyd ten w mniejszym stopniu moż­na również wyizolować z makrofagów, adipocytów, komórek nerki lub śledziony oraz wielu innych tkanek i komórek. W osoczu krwi hepcydyna krąży w postaci niezmienionej lub w połączeniu z α-2-makroglobuliną, ulegając prawie całkowitej filtracji w nerkach. Prawie 95% hep­cydyny z osocza jest filtrowane przez kłębuszki nerkowe, a następnie ulega wchłanianiu zwrotnemu i rozpadowi w kanalikach bliższych nerek. Jedynie 5% z osoczowej puli tego peptydu zostaje wydalona przez nerki w postaci niezmienio­nej. Hepcydynę uznawana jest za główną cząsteczkę sygnałową, biorącą udział w re­gulacji  metabolizmu żelaza [7].

Przemiany żelaza

Przemiany żelaza w organizmie zachodzą w układzie zamkniętym, a pierwiastek ten znajduje się w ciągłym obiegu. Do hemoglobiny wbudowywane jest ok. 25 mg żelaza na dobę. W puli żelazowej, zdecydowana większość (ok. 80%) żelaza pochodzi z hemoglobiny niszczonych krwinek czerwonych (erytrocytów), a 20% z pożywienia i puli zmagazynowanej w ustroju. Do wchłaniania żelaza dochodzi w dwunastnicy oraz bliższym odcinku jelita cienkiego [8]. Zawarty w pokarmach jon żelazowy Fe³+ przechodzi redukcję  do jonu żelazawego Fe²+. By do niej doszło spełnione muszą być odpowiednie warunki, tj. kwaśne pH żołądka oraz obecność reduktazy Fe w dwunastnicy. Do czynników, które ułatwiają wchłanianie Fe należą: witamina C, dieta bogata w białka i aminokwasy oraz niskie pH soku żołądkowego. Wśród czynników hamujących jego wchłanianie wymienia się stosowanie leków zobojętniających kwas żołądkowy (H2-blokery, inhibitory pompy protonowej), tetracyklin, chinolonów, a także picie kawy i herbaty [8].