W przypadku analizy wyników w cytofluorometrze przepływowym z każdego wgłębienia mikropłytki należy pobrać 5 μl osadu komórek i przenieść je do 700 μl rozcieńczonego buforu EDTA. Wyniki odczytywać tego samego dnia (w wyjątkowych przypadkach można zrobić to następnego dnia, jednakże wtedy mikropłytkę należy zabezpieczyć przed światłem, a także przechowywać w temp. 4⁰C.

Cytofluorometr przepływowy pozwala analizować od 5 000 do 10 000 komórek. Wyniki testu wyraża się na podstawie ilości komórek świecących. Kontrolą ujemną jest reakcja płytek krwi z surowicami bez przeciwciał od dawców grupy AB, z kolei za wynik dodatni przyjmowane są wartości średnie świecenia kontroli ujemnej (± 3 SD lub 4 SD) [16]. 

Izolacja płytek krwi przez wirowanie i przemywanie  (wg Mustard J.F. i wsp., 1989)

Procedura może być wykorzystywana do otrzymywania płytek krwi ze 120-150 ml krwi, jak również może być ona przystosowana do większych objętości próbek, przez zwiększenie proporcji wykorzystywanych odczynników (do przemywania i zawieszania otrzymanych płytek krwi). W poniższej metodzie płytki przetrzymywane są w temperaturze 37⁰C w trakcie trwania całej procedury.

Krew należy pobrać na antykoagulant (bufor ACT) do 50 ml probówek z poliwęglanu. Próbkę wirować przy 190 x g prze 15 minut w temp. 37⁰C, w celu otrzymani osocza bogatopłytkowego. Otrzymane osocze przenieść do 50 ml stożkowych probówek poliwęglanowych za pomocą pipety lub strzykawki. Osocze PRP odwirować przy 2500 z g przez 15 min, w temp. 37⁰C. Po wirowaniu usunąć zebrane osocze, a płytki ponownie (ostrożnie) zawiesić w 10 ml buforu Tyroda zawierającego heparynę (50 U/ml), albuminę (0,35%) oraz apyrazę (apyraza jest enzymem upłynniającym krew, zmniejszającym jej lepkość), pH 7.35, w temperaturze 37⁰C.

W opisanej metodzie należy użyć 10 razy większą ilość enzymu niż jest wymagana do stabilizacji płytek w medium, w którym są zawieszone. Istotne jest by płytki pozostawić w powyższym roztworze, przez co najmniej 15 minut, a następnie odwirować próbkę przy 1200 x g przez 10 min. (37⁰C). Po wirowaniu należy usunąć supernatant znad osadu, a płytki delikatnie zawiesić w buforze Tyroda zawierającym albuminę (0,35%) wraz z identyczną objętością apyrazy jak do pierwszego płukania (jak wyżej).

Jeżeli na dnie probówki jest dużo czerwonych krwinek należy unikać mieszania ich z płytkami. W tym celu próbkę należy dodatkowo odwirować (1200 x g, 15 min), usunąć supernatant i ponownie delikatnie zawiesić w buforze Tyroda z albuminą i apyrazą. Płytki krwi otrzymane powyższą metodą mogą być przechowywane przez dłuższy czas - do medium zawieszającego należy dodać buforu HEPES (kwas N-(2-Hydroksyetylo-piperazyno-N'-ethanosulfonowy) [21].

Barwienie płytek krwi za pomocą acetometoksylowego estra kalceiny (kalceina AM)

Zasada metody:

Kalceina AM jest niefluorescencyjnym, lipofilnym związkiem, który ma zdolność łatwego przenikania przez błonę plazmatyczną żywych komórek. Pod wpływem cytoplazmatycznych esteraz związek ten ulega hydrolizie do hydrofilowej, silnie fluoryzującej kalceiny. Kalceina w wolnej postaci zatrzymywana jest wewnątrz żywych komórek, które posiadają nienaruszoną błoną plazmatyczną. Wyciek znacznika z komórek do środowiska zewnątrzkomórkowego obserwowany jest w przypadku, gdy zostanie utracona integralność błony plazmatycznej. Wśród głównych cech wolnej kalceiny należy wymienić jej wysoką fotostabilność oraz niską wrażliwość na wewnątrzkomórkowe pH. Związek ten dodatkowo ma niską cytotoksyczność, dzięki czemu jest szeroko stosowany w badaniach [1].

Kalceina-AM, jest barwnikiem wnikającym do komórek, który stosowany jest do określania ich żywotności. Kalceina-AM to acetoksymetylowa estrowa pochodna kalceiny. Kalceina sama w sobie nie posiada właściwości fluorescencyjnych, z kolei jej ester w komórkach żywych emituje silne, zielone światło fluorescencji (wzbudzenie 490 nm, emisja 515 nm). Co najważniejsze, kalceina barwi tylko żywe komórki [6].