Izolacja oraz analiza wybranych parametrów płytek krwi cz. 2

Na rynku dostępne są gotowe zestawy testów enzymatycznych, produkowane przez różne firmy, wraz z niezbędnymi odczynnikami i dokładnym przepisem badania. Wśród nich znajdują się testy enzymatyczne na mikropłytkach, które są opłaszczone:

- krwinkami płytkowymi (test poza wykrywaniem swoistych przeciwciał płytkowych, umożliwia również oznaczenie przeciwciał HLA),

- glikoproteinami wyizolowanymi z błon krwinek płytkowych (np: GPIIb/IIIa, GPIb, GPIa/IIa), będącymi nośnikami odpowiednich swoistych antygenów HPA (test wykrywa swoiste przeciwciała płytkowe). W przeciwieństwie do testów enzymatycznych, test immunofluorescencyjny PIFT (ang. platelet immunofluorescence test- służący do wykrywania przeciwciał związanych z płytkami krwi) nie jest produkowany komercyjnie w związku, z czym laboratoria kliniczne posiadają własną metodologię jego przeprowadzania, która zazwyczaj obejmuje kilka etapów [16].

Pośredni test immunofluorescencyjny – PIFT był pierwszym testem, który znalazł szerokie zastosowanie do wykrywania przeciwciał płytkowych (zarówno allo- jak i autoprzeciwciał). Został on opisany w 1978r. przez von dem Borne i wsp. Bezpośredni test PIFT wykorzystywany jest do wykrywania przeciwciał związanych z płytkami krwi (autoprzeciwciał). Ponadto przeciwciała przeciwpłytkowe mogą być również wykrywane testem enzymatycznym (test ELISA), który jest metodą analogiczną do testu PIFT, gdzie stosuje się surowice antyglobulinowe sprzężone z enzymami. Wadą opisanych testów jest fakt wykrywania nie tylko swoistych przeciwciał płytkowych (anty-HPA), lecz również przeciwciał przeciwlimfocytarnych (anty-HLA). Dlatego też metody te nie nadają się do różnicowania tych dwóch rodzajów przeciwciał [17].

Izolacja płytek krwi

Wykonanie:

a) Krew pobraną na EDTA (w stosunku 1 ml EDTA i 9 ml krwi) należy odwirować przez 10 min (1500 obr./min lub 170 x g).

b) Po wirowaniu usunąć bogatopłytkowe osocze, po czym ponownie odwirować próbkę (5 minut, 3000 obr./min lub 700 x g).

c) Otrzymany po wirowaniu osad płytek krwi zalać 1-2 ml płynu do lizy erytrocytów (tj.: chlorek amonu do lizy erytrocytów: 4.15g NH₄ Cl, 0.5g KHCO₃ , 0.8 ml 5% EDTA, ml H₂O - jeżeli wyniki badań będą oceniane w CF, izolowane płytki krwi nie muszą być pozbawiane erytrocytów na drodze lizy chlorkiem amonu).

d) Próbkę inkubować w łaźni lodowej przez 5-10 minut (ten etap izolacji wykonywany jest w przypadku, gdy badania odczytywane są w mikroskopie fluorescencyjnym).

e) Otrzymane płytki krwi należy przepłukać 3-razy za pomocą rozcieńczonego buforu EDTA (przygotowany ze stężonego buforu EDTA: 10 ml stężonego buforu EDTA, 90 ml H₂0, 1 ml 20% albuminy wołowej, doprowadzić 3M NaOH do pH 7.2). Za każdym razem próbkę odwirować przez 5 minut przy 3000 obr./min. lub 700 x g).

f) Do osadu płytek krwi dodać 2 ml 1% paraformaldehydu w PBS, a dalej komórki utrwalać przez 5 minut w temp. 20-22⁰C.

g) Płytki krwi płukać (jak wyżej), a na koniec próbkę doprowadzić do gęstości około 250 x 10⁶/ml [16].

Wykonanie testu

a) Do zagłębień mikropłytki należy nanieść w następującej kolejności po 30 μl: surowic badanych, 2-3 surowice bez przeciwciał-grupy AB (kontrola ujemna), surowicę ze swoistymi przeciwciałami płytkowymi-anty-HPA1a (kontrola dodatnia). Do próbek dodać po 30 μl izolowanych płytek krwi. Przygotowaną w ten sposób mikropłytkę inkubować przez 30 minut w temperaturze 37⁰C.

b) Mikropłytkę przepłukać poprzez dodanie do zagłębień po 200 μl rozcieńczonego buforu EDTA, następnie wirować po 3 minuty przy 2500 obr/min lub 800 x g (w przypadku analizy na płkach plastykowych) bądź 3 minuty przy 3000 obr/min (1100 x g) w przypadku wykonywania testu w probówkach. Płukanie wykonać 3-krotnie, po każdym wirowaniu wytrząsnąć płyn płuczący, a mikropłytkę osuszyć na ligninie.

c) Dodać 30 μl odpowiedniego rozcieńczenia surowicy antyglobulinowej sprzężonej z FITC (tj. surowice antyglobulinowe F(ab’)₂ sprzeżone z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) skierowane przeciwko globulinom ludzkim klasy IgG+IgM+IgA (wieloswoiste) lub IgG czy IgM (monoswoiste), następnie zabezpieczoną folią aluminiowa mikropłytkę należy inkubować przez 30 min. w temp.20-22⁰C. Po upływie czasu inkubacji 3-krotnie przepłukać płytkę (jak wyżej).

d) Po ostatnim płukaniu wytrząsnąć płyn płuczący z wgłębień mikropłytki. W przypadku odczytywania wyników badania w mikroskopie fluorescencyjnym do każdego wgłębienia mikropłytki dodać po kropli PBS z dodatkiem glicerolu (1 kropla glicerolu oraz 4 krople PBS). Pobrać kroplę zawiesiny krwinek płytkowych i przenieść na szkiełko podstawowe, a po przykryciu szkiełkiem nakrywkowym preparat można oglądać w mikroskopie przy powiększeniu 400x. Reakcję uznaje się za dodatnią w przypadku pojawienia się charakterystycznego świecenia płytek krwi (w postaci jasnej fluoryzującej obwódki wokół komórek), w porównaniu z kontrolą ujemną (objawiającą się brak świecenia). Intensywność świecenia oceniania się w skali 1+ do 4+.