|
Zamknij X
|
Liofilizacja płytek krwi
W 1950 roku liofilizacja uznawana była za jedną z metod preparatyki płytek krwi. W wyniku zakrojonych badań wykazano, że najbardziej efektywna jest liofilizacja z zastosowaniem 1,8% paraformaldehydu z 5% albuminą. Dzięki temu nawodnione płytki krwi mają podobny wygląd do świeżych płytek, a także zachowana zostaje większość ich białek powierzchniowych. Liofilizacja zapewnia długą trwałość próbek [13].
Błona komórkowa płytki krwi stabilizowana jest za pomocą cytoszkieletu, a w jej skład wchodzą liczne glikoproteiny receptorowe, które sprzężone są z enzymatycznymi łańcuchami przekazywania sygnałów [2]. W trakcie aktywacji płytek krwi dochodzi do zmian w cytoszkielecie w wyniku, czego gładkie i owalne komórki przekształcają się w okrągłe z pseudopodiami. Z ziarnistości zostają uwalniane substancje, co z kolei prowadzi do końcowego oraz nieodwracalnego etapu ich aktywacji, czyli agregacji płytek. Zachodząca degranulacja ziarnistości płytek przyczynia się do uwalniania agonistów płytek (m.in. ADP, PAF) w wyniku, czego dochodzi do aktywacji kolejnych płytek w miejscu urazu bądź infekcji bakteryjnej [14].
Otrzymywanie frakcji cytoszkieletu z płytek krwi (frakcja nierozpuszczalna w Tritonie X-100, wg Fujimura i wsp., 1990)
Wykonanie:
Do 1 ml zawiesiny płytek krwi (płytki krwi otrzymane metodą wirowania osocza bogatopłytkowego, zawieszone w buforze Tyroda) należy dodać 0,1 ml roztworu trombiny (400 j. NIH/ml) do końcowego stężenia równego 1 j. NIH/ml). Przygotowaną w ten sposób próbkę należy poddać inkubacji w 37⁰C przez 2 minuty, po czym zatrzymać reakcję przez dodanie do próbki 1,1 ml 10 mM roztworu DIFP (diisopropyl fluorophosphate).
W kolejnym etapie do badanej próbki dodać równą objętość buforu o pH 7,4 (tj. 100 mM Tris/HCl – 2% Triton X-100 – 4 mM EDTA). Próbkę odstawić na około 15-20 minut, a następnie odwirować przy 5 000 obr./min przez 5 minut. Otrzymany osad (frakcja nierozpuszczalna w Tritonie) przemyć 2- krotnie: pierwsze przepłukanie wykonać za pomocą rozcieńczonego w stosunku 1:1 buforu o pH= 7,4 (bufor rozcieńczyć 0,9% NaCl), a drugie przepłukanie osadu wykonać samym 0,9% roztworem NaCl.
Otrzymaną frakcję białek cytoszkieletu rozpuścić w roztworze składającym się z 2% SDS oraz 8 M mocznika. Białka należy analizować podczas elektroforetycznego rozdziału w żelu poliakrylamidowym (elektroforezę przeprowadzić w 8% i 12% żelu z SDS wg metody Laemmliego).
W celu otrzymania preparatów zredukowanych, do próbek należy dodać β-merkaptoetanol (do końcowego stężenia 1,4%) i ogrzewać w temp. 100⁰C przez 5 minut. Wybarwienie żeli wykonać za pomocą błękitu Coomassie Brilliant Blue G-250 [2].
Autor: Zuzanna Koperwas
LITERATURA:
25 maja 2018 roku zacznie obowiązywać Rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) 2016/679 z dnia 27 kwietnia 2016 r (RODO). Potrzebujemy Twojej zgody na przetwarzanie Twoich danych osobowych przechowywanych w plikach cookies. Poniżej znajdziesz pełny zakres informacji na ten temat.
Zgadzam się na przechowywanie na urządzeniu, z którego korzystam tzw. plików cookies oraz na przetwarzanie moich danych osobowych pozostawianych w czasie korzystania przeze mnie ze strony internetowej Laboratoria.net w celach marketingowych, w tym na profilowanie i w celach analitycznych.
Administratorami Twoich danych będziemy my: Portal Laboratoria.net z siedzibą w Krakowie (Grupa INTS ul. Czerwone Maki 55/25 30-392 Kraków).
Chodzi o dane osobowe, które są zbierane w ramach korzystania przez Ciebie z naszych usług w tym zapisywanych w plikach cookies.
Przetwarzamy te dane w celach opisanych w polityce prywatności, między innymi aby:
dopasować treści stron i ich tematykę, w tym tematykę ukazujących się tam materiałów do Twoich zainteresowań,
dokonywać pomiarów, które pozwalają nam udoskonalać nasze usługi i sprawić, że będą maksymalnie odpowiadać Twoim potrzebom,
pokazywać Ci reklamy dopasowane do Twoich potrzeb i zainteresowań.
Zgodnie z obowiązującym prawem Twoje dane możemy przekazywać podmiotom przetwarzającym je na nasze zlecenie, np. agencjom marketingowym, podwykonawcom naszych usług oraz podmiotom uprawnionym do uzyskania danych na podstawie obowiązującego prawa np. sądom lub organom ścigania – oczywiście tylko gdy wystąpią z żądaniem w oparciu o stosowną podstawę prawną.
Masz między innymi prawo do żądania dostępu do danych, sprostowania, usunięcia lub ograniczenia ich przetwarzania. Możesz także wycofać zgodę na przetwarzanie danych osobowych, zgłosić sprzeciw oraz skorzystać z innych praw.
Każde przetwarzanie Twoich danych musi być oparte na właściwej, zgodnej z obowiązującymi przepisami, podstawie prawnej. Podstawą prawną przetwarzania Twoich danych w celu świadczenia usług, w tym dopasowywania ich do Twoich zainteresowań, analizowania ich i udoskonalania oraz zapewniania ich bezpieczeństwa jest niezbędność do wykonania umów o ich świadczenie (tymi umowami są zazwyczaj regulaminy lub podobne dokumenty dostępne w usługach, z których korzystasz). Taką podstawą prawną dla pomiarów statystycznych i marketingu własnego administratorów jest tzw. uzasadniony interes administratora. Przetwarzanie Twoich danych w celach marketingowych podmiotów trzecich będzie odbywać się na podstawie Twojej dobrowolnej zgody.
Dlatego też proszę zaznacz przycisk "zgadzam się" jeżeli zgadzasz się na przetwarzanie Twoich danych osobowych zbieranych w ramach korzystania przez ze mnie z portalu *Laboratoria.net, udostępnianych zarówno w wersji "desktop", jak i "mobile", w tym także zbieranych w tzw. plikach cookies. Wyrażenie zgody jest dobrowolne i możesz ją w dowolnym momencie wycofać.
Więcej w naszej POLITYCE PRYWATNOŚCI
Recenzje