Wykorzystanie metody turbidymetrycznej do pomiaru agregacji płytek krwi

Do pomiaru agregacji płytek krwi wykorzystywany jest tzw. agregometr, gdzie zasada całego pomiaru polega na obserwacji zachodzących zmian w przepuszczalności światła przez osocze bogatopłytkowe (agregacja wywołana ADP) lub zawiesinę krwinek płytkowych w buforze Tyroda (agregacja wywołana trombiną). Z Wraz ze zlepianiem się krwinek płytkowych zwiększa się przepuszczalność światła, a wynik pomiaru podaje się jako odsetek agregacji, gdzie przyjmuje się za 100% agregacji – absorbancję buforu bez płytek lub osocza ubogopłytkowego, a za 0% agregacji – absorbancję płytek niestymulowanych.

Jako materiał do badań należy wykorzystać płytki krwi otrzymane metodą wirowania osocza bogatopłytkowego i zawieszone w buforze Tyroda (bądź też cytrynianowe osocze bogatopłytkowe).

Odczynniki:

1) Bufor Tyroda: 10 mM HEPES, 140 mM NaCl, mM KCl, 0,5 mM MgCl₂, 5 mM NaHCO₃, 10 mM glukoza (pH= 7,4)

2) Trombina (400 j. NIH/ml)

3) 10 mM roztwór ADP

Wykonanie oznaczenia: do kuwety agregometru należy wprowadzić 250 µl osocza bogatopłytkowego, zawierającego 2x10⁸ płytek w ml bądź zawiesinę krwinek płytkowych (liczba płytek 2-3x10⁸/ml). Próbkę mieszać dipolem magnetycznym ze stałą szybkością 1200 obr./min, należy rejestrować transmitancję (przy p600 nm) w agregatorze przed dodaniem czynnika agregującego. Dalej obserwować wzrost transmitancji po dodaniu 2,5 – 5 µl czynnika agregującego (trombina lub ADP) bezpośrednio do kuwety pomiarowej. Zmiany transmitancji zachodzące w zawiesinie płytek lub osocza bogatopłytkowego należy oznaczać wobec buforu Tyroda lub osocza ubogopłytkowego.

Proces agregacji płytek może być śledzony dzięki zastosowaniu w aparacie czytnika mikropłytek w świetle o długości fali λ= 595 nm. W tym celu do 2 studzienek aparatu należy wprowadzić po 200 µl zawiesiny płytek, a do trzeciej studzienki bufor Tyroda, a dalej:

- do pierwszej studzienki (próba kontrolna) dodać 2,5 – 5 µl buforu Tyroda

- do drugiej studzienki 2,5-5 µl trombiny.

Następnie należy rejestrować zmiany absorbancji zawiesiny płytek w każdej studzience wobec buforu Tyroda, przestrzegając okresowego wytrząsania zawiesiny, które należy prowadzić co minutę w ciągu 10 minut [2].

Agregacja płytek krwi może być mierzona, jako ilość utworzonych agregatów płytkowych i uwalnianych nukleotydów adeninowych oraz białek zmagazynowanych w ziarnistościach płytkowych. Przeprowadzone badania (in vitro) wykazały, że związek cisplatyna (stosowana, jako lek cytostatyczny w chemioterapii) ma zdolność hamowania aktywacji płytek krwi, co też potwierdzono wieloma badaniami [13].

Pomiar agregacji płytek po stymulacji ADP

a) Izolowanie płytek krwi: płytki krwi otrzymywano metodą wirowania różnicowego świeżej krwi pobranej na roztwór ACD (tj. 65 mM kwas cytrynowy, 85 mM cytrynian sodu, 110 mM glukoza, 5:1 v/v). Następnie komórki przemywano 2x zmodyfikowanym buforem Tyroda, a następnie zawieszano w tym samym buforze do stężenia 10 mg białka płytek/ml. Stężenie białka w próbce oznaczano zmodyfikowaną metodą Lowry’ego.

b) Pomiar agregacji płytek krwi: pomiar przeprowadzono w agregatorze, stosując osocze bogatopłytkowe zawierające 2 x 10⁸ płytek w ml. Osocze bogatopłytkowe inkubowano przez 5-minut z cisplatyną (20 µM), a następnie wywoływano agregację przez dodanie do próbki roztworu ADP (10 µM) [13].

Cisplatyna powoduje wyraźne zahamowanie procesu agregacji. W zależności od zastosowanej dawki i czasu inkubacji z płytkami krwi, związek ten zmniejsza również sekrecję białek komórkowych. Właściwości te przemawiają za stosowaniem cisplatyny w leczeniu różnych nowotworów. Niestety kliniczne zastosowanie leku jest ograniczone m.in. ze względu na jego toksyczność hematologiczną. Co więcej, zahamowanie aktywacji płytek krwi pod wpływem działania cisplatyny może prowadzić do ograniczenia udziału płytek krwi w procesie metastazy [13].