Płytkowa reakcja uwalniania (wg Wachowicz B., 1984)

Krwinki płytkowe zdolne są do selektywnego wyrzucania poza komórkę wielu związków. Zjawisko to zachodzi w warunkach in vitro pod wpływem specyficznych agonistów. Co więcej zjawisko to jest charakterystyczne jedynie dla płytek krwi. Z obecnych w komórce ziarnistości typu α uwalniane są albuminy i białka o różnej aktywności biologicznej, z kolei z ziarnistości osmofilnych uwalniane są m.in. nukleotydy adeninowe, które mogą być oznaczane spektrofotometrycznie w odbiałczonym supernatancie. Ilość białka uwolnionego z płytek krwi można z kolei oznaczyć metodą Lowry’ego [2].

Wykonanie oznaczenia

Jako materiał do badań należy wykorzystać próbkę płytek krwi otrzymanych metodą wirowania osocza bogatopłytkowego, które następnie zawieszono w buforze Tyroda (ok. 10 mg białka/ml).

Do 2 probówek należy wprowadzić po 1 ml zawiesiny płytek krwi, a następnie do pierwszej próbki dodać 0,5 ml buforu Tyroda, a do drugiej próbki 0,5 ml trombiny (40 - 50 j. NIH/ml). Próbki inkubować w 37⁰C przez 15 minut, a następnie oziębić i odwirować je przy 4 000 obr./min przez 10 minut. W otrzymanym po wirowaniu supernatancie należy zbadać obecność:

a)nukleotydów adeninowych: w tym celu do 0,5 ml próbki dodać 0,5 ml 1,2 M roztworu HClO₄ , po czym próbkę oziębić na lodzie. Po upływie 10 minut próbkę odwirować (3 000 obr./min, 10 minut), a otrzymany po wirowaniu osad białka odrzucić. Do klarownego supernatantu dodać 4 objętości 0,6 M roztworu HClO₄, a dalej oznaczyć absorbancję w 260 nm wobec 0,6 M roztworu HClO_4, Ilość nukleotydów (podaną w nmol) należy wyliczyć na podstawie krzywej wzorcowej wykreślonej dla wzorca – ADP w zakresie 10 – 50 nmol/ml [2].

b)uwolnionych białek: w tym celu pobrać 0,5 ml supernatantu płytek kontrolnych i aktywowanych trombiną. W próbce oznaczyć stężenie białka i uwzględnić je w supernatancie zawierającym dodaną trombinę [2].

Oznaczanie zawartości anionorodnika ponadtlenkowego w płytkach krwi na podstawie redukcji cytochromu [2].

W pobudzonych płytkach krwi (po inkubacji z trombiną) zachodzi produkcja anionorodnika ponadtlenkowego, którego powstawanie w komórce związane jest z enzymatyczną przemianą endogennego arachdonianu oraz cyklem glutationowym płytek krwi. W celu wykrycia i oszacowania ilości wytworzonego anionorodnika najczęściej wykorzystywane są metody pośrednie. Metody te opierają się na spektrofotometrycznych pomiarach reakcji anionorodnika ponadtlenkowego, które prowadzą do powstania barwnych produktów bądź zmian widma pochłaniania substancji. Wśród najczęściej wykorzystywanych reakcji jest redukcja ferricytochromu c do ferrocytochromu. Przebieg całej reakcji można śledzić spektrofotometrycznie, dzięki zmianom widm absorpcji światła. Przyrost absorpcji mierzony jest przy λ=550 nm.

Cytochrom c nie ma o przenikania przez błonę komórkową, a jego redukcja spowodowana przez anionorodnik ponadtlenkowy w zawiesinie komórek świadczy o uwolnieniu anionorodnika na zewnątrz komórek. W obecności dysmutazy ponadtlenkowej (zazwyczaj w stężeniu 1µg/mg białka płytkowego) można zaobserwować spadek absorbancji przy długości fali równej λ= 550 nm, co z kolei wskazuje na usuwanie generowanego anionorodnika ponadtlenkowego.

Wykonanie oznaczenia:

Jako materiał do badań należy wykorzystać płytki krwi otrzymane metodą wirowania osocza bogatopłytkowego i zawieszone w buforze Tyroda.

Do 1 ml płytek krwi stymulowanych trombiną (5 j. NIH/ml, w temp. 37⁰C przez 5 minut) i niestymulowanych (stanowiących próbkę kontrolną) należy dodać równą objętość cytochromu c o stężeniu 160 µM (roztwór cytochromu c w buforze Tyroda). Próbki odwirować przez 5 minut przy 1500 obr./min. Następnie w otrzymanym supernatancie należy oznaczyć absorbancję przy λ= 550 nm.

W celu oznaczenia anionorodnika ponadtlenkowego należy skorzystać z molowego współczynnika absorpcji dla cytochromu c, który wynosi 18 700 M^-1 x cm^-1 [2].

Chemiluminescencja płytek krwi

Chemiluminescencja (CL) towarzyszy szeregu normalnym reakcjom enzymatycznym zachodzącym w układach biologicznych (wliczając w nie np. peroksydację lipidów w mikrosomach wątroby) [8]. W trakcie aktywacji płytek krwi oprócz anionorodnika ponadtlenkowego, wytwarzane są również inne wolne rodniki, których zawartość można zmierzyć metodą chemiluminescencji z użyciem chemiluminometru.

Chemiluminescencja to emisja światła towarzysząca reakcji chemicznej. Najczęściej stosowanym związkiem w reakcjach, którym towarzyszy powstawanie wolnych rodników tlenowych jest tzw. luminol. W trakcie przejścia formy wzbudzonej związku do stanu podstawowego emitowany jest kwant promieniowania elektromagnetycznego, odpowiadającemu światłu o λ= 450 nm. W reakcjach, w których powstają wolne rodniki tlenowe dochodzi do wzbudzenia luminolu [2].