Akceptuję
W ramach naszej witryny stosujemy pliki cookies w celu świadczenia państwu usług na najwyższym poziomie, w tym w sposób dostosowany do indywidualnych potrzeb. Korzystanie z witryny bez zmiany ustawień dotyczących cookies oznacza, że będą one zamieszczone w Państwa urządzeniu końcowym. Możecie Państwo dokonać w każdym czasie zmiany ustawień dotyczących cookies. Więcej szczegółów w naszej Polityce Prywatności

Zamknij X
Reklama
Strona główna Artykuły
Dodatkowy na dole

Dodatkowy u góry

Techniki wykorzystywane do barwienia komórek bakteryjnych

Przygotowanie podłoża z zielenią malachitową (Lowestein-Jensen)

Składniki podłoża L-J:

Diwodorofosforan potasu bezwodny (bezwodny, KH2PO4) – 2,4 g

Siarczan magnezu (bezwodny) - 0,24 g

Cytrynian magnezu – 0,6 g

Asparagina – 3,6 g

Glicerol – 12 ml

Zieleń malachitowa – 2% roztwór

W 300 ml wody destylowanej rozpuścić przez ogrzewanie kolejno: glicerol, zieleń malachitową, po czym uzupełnić  600 ml wody destylowanej. Otrzymany roztwór należy sterylizować w autoklawie (w 121°C) przez 30 minut. Po sterylizacji roztwór schłodzić do temperatury pokojowej.

 

Homogenizacja całych jajek

Świeże jajka kurze (nie starsze niż 7 dniowe) należy dokładnie umyć wodą z mydłem, następnie wypłukać pod bieżącą wodą i zanurzyć w 70% etanolu na 15 minut. Przed wyciągnięciem jajek należy również umyć ręce środkiem dezynfekującym. Następnie jajka wbić do sterylnej (jałowej kolby) i miksować przez 30 sekund sterylnym mikserem (max. 1 minutę).

Przygotowanie kompletnej pożywki

W dużej sterylnej kolbie wymieszać kolejno:

- 600 ml roztworu z zielenią malachitową

- homogenizowane jajka (25-30 jajek) – 1000 ml

Mieszaninę należy rozlać po 6-8 ml do sterylnych probówkach, szczelnie zamknąć nakrętką i zagęścić, w celu zapobiegnięcia sedymentacji cięższych składników [16].

 

Kontrola sterylności

Całą partia przygotowanych probówek (lub butelek) z pożywką powinna być inkubowana w temperaturze 35°C- 37°C przez 24 godziny w celu kontroli jałowości. Po upływie 24 godzin, z całej puli należy losowo wybrać 5% probówek (stocków), które będą dalej inkubowane przez 14 dni (sprawdzenie sterylności pod kątem grzybów). W obu przypadkach szybkość zanieczyszczenia nie powinna być >10% . Przygotowane i sprawdzone w powyższy sposób podłoże L-J może być przechowywane przez 4 tygodnei (szczelnie zamknięte)[16].

 

Koagulacja (tężenie) pożywki

Probówki z pożywką podgrzewać w temp. 85°C (podgrzewanie prowadzi do zestalenia się podłoża, a nie jego sterylizacji). Jakość pożywki z jajkami pogarsza się kiedy zestalanie prowadzone jest w zbyt wysokiej temperaturze przez długi czas (zabarwienie skoagulowanego podłoża może być spowodowane nadmierną temperaturą). Powstałe w trakcie zestalania pożywki pęcherzyki lub otwory (na jej powierzchni) również świadczą o wadliwej procedurze krzepnięcia [16].

 

Barwienie Neissera

Barwienie metodą Neissera wykorzystywane jest do wykrywania w komórkach bakterii ziarnistości zapasowych. W metodzie wykorzystywane sa kolejno odczynniki:

  • arwnik Neissera, w którego skład wchodzą 2 składniki łączone bezpośrednio przed barwieniem, tj.:  alkoholowo-wodny roztwór błękitu metylenowego (odczynnik Neisser I) oraz alkoholowo-wodny roztwór fioletu krystalicznego (odczynnik Neisser II)
  • wodny roztwór chryzoidyny. W porównaniu do innych typów barwień, w metodzie Neissera barwniki nie są spłukiwane ze szkiełek wodą [13].

 

Wykonanie:

Przed przystąpieniem do barwienia należy przygotować barwnik Neissera przez zmieszanie: dwóch części barwnika Neisser I z jedną częścią barwnika Neisser II. Następnie na utrwalony preparat należy nalać wymieszany barwnik, odczekać 5 minut, po czym dokładnie zlać barwnik (nie spłukiwać wodą). W kolejnym etapie na szkiełko nalać roztwór chryzoidyny (odczekać ok. 10-15 sekund) i ponownie zlać barwnik z  preparatu. Preparat odcisnąć w bibule. W wyniku barwienia ziarnistości zapasowe (wolutynowe) wybarwią się na kolor granatowo-czarny,a  komórki  na żółto [13].

 

Metoda Ziehl-Neelsena

Wykorzystywana jest do uwidaczniania drobnoustrojów posiadających cechę kwasooporności (prątki, niektóre promieniowce, a także niektóre przetrwalniki laseczek tlenowych i beztlenowych). Bakterie kwasooporne mają ścianę komórkową charakteryzującą się odmienną budową w porównaniu do bakterii „niekwasoopornych (wykazują dużą ilość lipidów w ścianie). Kwasooporność warunkuje obecność m.in. kwasu mykolowego, z którym wiąże się użyty w trakcie barwienia barwnik. Bakterie kwasooporne różnią się od wszystkich innych bakterii tym, że po wybarwieniu ich gorącym, stężonym roztworem fuksyny karbolowej nie ulegają odbarwieniu przez kwasy nieorganiczne ani mieszaninę kwasu i etanolu [1],[2],[7].

Za pomocą barwienia Ziehl-Nielsena można sprawdzić kwasooporność komórek bakteryjnych. Barwienie polega na wprowadzeniu do komórek, na gorąco, roztworu fuksyny karbolowej, która w kolejnych etapach wypłukiwana jest z komórki roztworem alkoholu etylowego zakwaszonego kwasem solnym. W metodzie dodatkowo stosowane jest dobarwianie barwnikiem kontrastowym- błękitem metylenowym (ułatwia to również rozpoznawanie prątków na niebieskim tle preparatu, które przybierają kolor czerwony) [1],[2].

Metoda Ziehl-Neelsena (Z-N) stosowana jest powszechnie do barwienia mykobakterii. W trakcie metody wykorzystywana jest cecha kwasooporności Mycobacterium związanej z obecnością w ich ścianie komórkowej dużej ilości lipidów i wosków, które łączą się z barwnikami anilinowymi w trwały, nierozpuszczalny związek. Wybarwione preparaty ogląda się w mikroskopie świetlnym, gdzie komórki prątków wybarwiają się na kolor czerwono-purpurowy. Hodowle komórkowe, które są bardzo  młode i w których kwasy mykolowe są dopiero syntetyzowane, mogą nie wybarwiać się w ogóle (lub bardzo słabo) metodą Z-N [10].


Tagi: barwniki, metody barwienia, barwienie metodą Grama, preparat, odbarwianie, analiza mikroskopowa, bakterie gram-zmienne, fuksyna karbolowa, jodek heksydyny, barwienie kwasooporne, metoda Ziehl-Neelsena, pożywka Lowenstein-Jensen, Mycobacterium tuberculosis
Drukuj PDF
wstecz Podziel się ze znajomymi

Recenzje



lewybanner1
Informacje dnia: Fizyczny Nobel 2019 za poznanie Wszechświata i egzoplanet Badania pokazują, dlaczego płodność kobiet zmienia się z wiekiem Więcej energii to więcej efektów – w zderzeniach protonów Niektóre częste choroby i krótki sen to śmiertelne połączenie Nobel z fizjologii i medycyny Nanocząstki w zwalczaniu raka Fizyczny Nobel 2019 za poznanie Wszechświata i egzoplanet Badania pokazują, dlaczego płodność kobiet zmienia się z wiekiem Więcej energii to więcej efektów – w zderzeniach protonów Niektóre częste choroby i krótki sen to śmiertelne połączenie Nobel z fizjologii i medycyny Nanocząstki w zwalczaniu raka Fizyczny Nobel 2019 za poznanie Wszechświata i egzoplanet Badania pokazują, dlaczego płodność kobiet zmienia się z wiekiem Więcej energii to więcej efektów – w zderzeniach protonów Niektóre częste choroby i krótki sen to śmiertelne połączenie Nobel z fizjologii i medycyny Nanocząstki w zwalczaniu raka

Partnerzy

GoldenLine Fundacja Kobiety Nauki Job24 Obywatele Nauki NeuroSkoki Portal MaterialyInzynierskie.pl Uni Gdansk MULTITRAIN I MULTITRAIN II Nauki przyrodnicze KOŁO INZYNIERÓW PB ICHF PAN FUNDACJA JWP NEURONAUKA Mlodym Okiem Polski Instytut Rozwoju Biznesu Analityka Nauka w Polsce CITTRU - Centrum Innowacji, Transferu Technologii i Rozwoju Uniwersytetu Akademia PAN Chemia i Biznes Farmacom Świat Chemii Forum Akademickie Biotechnologia     Geodezja Instytut Lotnictwa EuroLab

Szanowny Czytelniku!

 
25 maja 2018 roku zacznie obowiązywać Rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) 2016/679 z dnia 27 kwietnia 2016 r (RODO). Potrzebujemy Twojej zgody na przetwarzanie Twoich danych osobowych przechowywanych w plikach cookies. Poniżej znajdziesz pełny zakres informacji na ten temat.
 
Zgadzam się na przechowywanie na urządzeniu, z którego korzystam tzw. plików cookies oraz na przetwarzanie moich danych osobowych pozostawianych w czasie korzystania przeze mnie ze strony internetowej Laboratoria.net w celach marketingowych, w tym na profilowanie i w celach analitycznych.

Kto będzie administratorem Twoich danych?

Administratorami Twoich danych będziemy my: Portal Laboratoria.net z siedzibą w Krakowie (Grupa INTS ul. Czerwone Maki 55/25 30-392 Kraków).

O jakich danych mówimy?

Chodzi o dane osobowe, które są zbierane w ramach korzystania przez Ciebie z naszych usług w tym zapisywanych w plikach cookies.

Dlaczego chcemy przetwarzać Twoje dane?

Przetwarzamy te dane w celach opisanych w polityce prywatności, między innymi aby:

  • dopasować treści stron i ich tematykę, w tym tematykę ukazujących się tam materiałów do Twoich zainteresowań,

  • dokonywać pomiarów, które pozwalają nam udoskonalać nasze usługi i sprawić, że będą maksymalnie odpowiadać Twoim potrzebom,

  • pokazywać Ci reklamy dopasowane do Twoich potrzeb i zainteresowań.

Komu możemy przekazać dane?

Zgodnie z obowiązującym prawem Twoje dane możemy przekazywać podmiotom przetwarzającym je na nasze zlecenie, np. agencjom marketingowym, podwykonawcom naszych usług oraz podmiotom uprawnionym do uzyskania danych na podstawie obowiązującego prawa np. sądom lub organom ścigania – oczywiście tylko gdy wystąpią z żądaniem w oparciu o stosowną podstawę prawną.

Jakie masz prawa w stosunku do Twoich danych?

Masz między innymi prawo do żądania dostępu do danych, sprostowania, usunięcia lub ograniczenia ich przetwarzania. Możesz także wycofać zgodę na przetwarzanie danych osobowych, zgłosić sprzeciw oraz skorzystać z innych praw.

Jakie są podstawy prawne przetwarzania Twoich danych?

Każde przetwarzanie Twoich danych musi być oparte na właściwej, zgodnej z obowiązującymi przepisami, podstawie prawnej. Podstawą prawną przetwarzania Twoich danych w celu świadczenia usług, w tym dopasowywania ich do Twoich zainteresowań, analizowania ich i udoskonalania oraz zapewniania ich bezpieczeństwa jest niezbędność do wykonania umów o ich świadczenie (tymi umowami są zazwyczaj regulaminy lub podobne dokumenty dostępne w usługach, z których korzystasz). Taką podstawą prawną dla pomiarów statystycznych i marketingu własnego administratorów jest tzw. uzasadniony interes administratora. Przetwarzanie Twoich danych w celach marketingowych podmiotów trzecich będzie odbywać się na podstawie Twojej dobrowolnej zgody.

Dlatego też proszę zaznacz przycisk "zgadzam się" jeżeli zgadzasz się na przetwarzanie Twoich danych osobowych zbieranych w ramach korzystania przez ze mnie z portalu *Laboratoria.net, udostępnianych zarówno w wersji "desktop", jak i "mobile", w tym także zbieranych w tzw. plikach cookies. Wyrażenie zgody jest dobrowolne i możesz ją w dowolnym momencie wycofać.
 
Więcej w naszej POLITYCE PRYWATNOŚCI
 

Newsletter

Zawsze aktualne informacje