Przygotowanie podłoża z zielenią malachitową (Lowestein-Jensen)

Składniki podłoża L-J:

Diwodorofosforan potasu bezwodny (bezwodny, KH₂PO₄) – 2,4 g

Siarczan magnezu (bezwodny) - 0,24 g

Cytrynian magnezu – 0,6 g

Asparagina – 3,6 g

Glicerol – 12 ml

Zieleń malachitowa – 2% roztwór

W 300 ml wody destylowanej rozpuścić przez ogrzewanie kolejno: glicerol, zieleń malachitową, po czym uzupełnić  600 ml wody destylowanej. Otrzymany roztwór należy sterylizować w autoklawie (w 121°C) przez 30 minut. Po sterylizacji roztwór schłodzić do temperatury pokojowej.

Homogenizacja całych jajek

Świeże jajka kurze (nie starsze niż 7 dniowe) należy dokładnie umyć wodą z mydłem, następnie wypłukać pod bieżącą wodą i zanurzyć w 70% etanolu na 15 minut. Przed wyciągnięciem jajek należy również umyć ręce środkiem dezynfekującym. Następnie jajka wbić do sterylnej (jałowej kolby) i miksować przez 30 sekund sterylnym mikserem (max. 1 minutę).

Przygotowanie kompletnej pożywki

W dużej sterylnej kolbie wymieszać kolejno:

- 600 ml roztworu z zielenią malachitową

- homogenizowane jajka (25-30 jajek) – 1000 ml

Mieszaninę należy rozlać po 6-8 ml do sterylnych probówkach, szczelnie zamknąć nakrętką i zagęścić, w celu zapobiegnięcia sedymentacji cięższych składników [16].

Kontrola sterylności

Całą partia przygotowanych probówek (lub butelek) z pożywką powinna być inkubowana w temperaturze 35°C- 37°C przez 24 godziny w celu kontroli jałowości. Po upływie 24 godzin, z całej puli należy losowo wybrać 5% probówek (stocków), które będą dalej inkubowane przez 14 dni (sprawdzenie sterylności pod kątem grzybów). W obu przypadkach szybkość zanieczyszczenia nie powinna być >10% . Przygotowane i sprawdzone w powyższy sposób podłoże L-J może być przechowywane przez 4 tygodnei (szczelnie zamknięte)[16].

Koagulacja (tężenie) pożywki

Probówki z pożywką podgrzewać w temp. 85°C (podgrzewanie prowadzi do zestalenia się podłoża, a nie jego sterylizacji). Jakość pożywki z jajkami pogarsza się kiedy zestalanie prowadzone jest w zbyt wysokiej temperaturze przez długi czas (zabarwienie skoagulowanego podłoża może być spowodowane nadmierną temperaturą). Powstałe w trakcie zestalania pożywki pęcherzyki lub otwory (na jej powierzchni) również świadczą o wadliwej procedurze krzepnięcia [16].

Barwienie Neissera

Barwienie metodą Neissera wykorzystywane jest do wykrywania w komórkach bakterii ziarnistości zapasowych. W metodzie wykorzystywane sa kolejno odczynniki:

• arwnik Neissera, w którego skład wchodzą 2 składniki łączone bezpośrednio przed barwieniem, tj.:  alkoholowo-wodny roztwór błękitu metylenowego (odczynnik Neisser I) oraz alkoholowo-wodny roztwór fioletu krystalicznego (odczynnik Neisser II)
• wodny roztwór chryzoidyny. W porównaniu do innych typów barwień, w metodzie Neissera barwniki nie są spłukiwane ze szkiełek wodą [13].

Wykonanie:

Przed przystąpieniem do barwienia należy przygotować barwnik Neissera przez zmieszanie: dwóch części barwnika Neisser I z jedną częścią barwnika Neisser II. Następnie na utrwalony preparat należy nalać wymieszany barwnik, odczekać 5 minut, po czym dokładnie zlać barwnik (nie spłukiwać wodą). W kolejnym etapie na szkiełko nalać roztwór chryzoidyny (odczekać ok. 10-15 sekund) i ponownie zlać barwnik z  preparatu. Preparat odcisnąć w bibule. W wyniku barwienia ziarnistości zapasowe (wolutynowe) wybarwią się na kolor granatowo-czarny,a  komórki  na żółto [13].

Metoda Ziehl-Neelsena

Wykorzystywana jest do uwidaczniania drobnoustrojów posiadających cechę kwasooporności (prątki, niektóre promieniowce, a także niektóre przetrwalniki laseczek tlenowych i beztlenowych). Bakterie kwasooporne mają ścianę komórkową charakteryzującą się odmienną budową w porównaniu do bakterii „niekwasoopornych (wykazują dużą ilość lipidów w ścianie). Kwasooporność warunkuje obecność m.in. kwasu mykolowego, z którym wiąże się użyty w trakcie barwienia barwnik. Bakterie kwasooporne różnią się od wszystkich innych bakterii tym, że po wybarwieniu ich gorącym, stężonym roztworem fuksyny karbolowej nie ulegają odbarwieniu przez kwasy nieorganiczne ani mieszaninę kwasu i etanolu [1],[2],[7].

Za pomocą barwienia Ziehl-Nielsena można sprawdzić kwasooporność komórek bakteryjnych. Barwienie polega na wprowadzeniu do komórek, na gorąco, roztworu fuksyny karbolowej, która w kolejnych etapach wypłukiwana jest z komórki roztworem alkoholu etylowego zakwaszonego kwasem solnym. W metodzie dodatkowo stosowane jest dobarwianie barwnikiem kontrastowym- błękitem metylenowym (ułatwia to również rozpoznawanie prątków na niebieskim tle preparatu, które przybierają kolor czerwony) [1],[2].

Metoda Ziehl-Neelsena (Z-N) stosowana jest powszechnie do barwienia mykobakterii. W trakcie metody wykorzystywana jest cecha kwasooporności Mycobacterium związanej z obecnością w ich ścianie komórkowej dużej ilości lipidów i wosków, które łączą się z barwnikami anilinowymi w trwały, nierozpuszczalny związek. Wybarwione preparaty ogląda się w mikroskopie świetlnym, gdzie komórki prątków wybarwiają się na kolor czerwono-purpurowy. Hodowle komórkowe, które są bardzo  młode i w których kwasy mykolowe są dopiero syntetyzowane, mogą nie wybarwiać się w ogóle (lub bardzo słabo) metodą Z-N [10].