Barwienie Grama żywych komórek

Bakterie pobrane z logarytmicznej fazy wzrostu hodowli traktuje się mieszaniną dwóch fluoryzujących barwników.  Każdy z zastosowanych barwników jest selektywny dla kwasów nukleinowych (barwnik SYTO® 9 i jodek heksydyny).

W przypadku bakterii gramdodatnich kwasy nukleinowe wybiórczo wybarwia jodek heksydyny, który skutecznie współzawodniczy z barwnikiem SYTO® 9 o miejsca wiązania. Z kolei kwasy nukleinowe bakterii gramujemnych wybarwiają się barwnikiem SYTO® 9, ponieważ tylko ten barwnik ma zdolność przenikania przez ich błonę zewnętrzną. W promieniowaniu o długości fali równej ok. λ= 480 nm, związany jodek heksydyny fluoryzuje na pomarańczowo, a SYTO® 9  na zielono [1].

Znane są różne teorie, wyjaśniające podział bakterii na Gram-dodatnie oraz Gram-ujemne. Teorie te obejmują różnice w cytoplazmatycznym pH. Według przeprowadzonych badań bakterie Gram-dodatnie wykazują pH=2, zaś Gram-ujemne 3, jednak pogląd ten nie został powszechnie zaakceptowany. Najbardziej prawdopobnym czynnikiem decydującym o właściwościach komórek bakterii jest grubość ściany komórkowej tych organizmów. Bakterie Gram-dodatnie mają grubszą ścianę, z kole Gram-ujemne cechuje obecność większej ilości lipidów w komórce [6].

Modyfikacje w metodzie barwienia Grama [6].

Od momentu wynalezienia tego typu barwienia, w metodzie wprowadzono kilka modyfikacji:

1) Modyfikacja Kopeloff i Beerman’a: pierwotny roztwór barwiący składał się z ze świeżego fioletu metylowego z węglanem sodu w wodzie destylowanej. Odbarwianie preparatu wykonywano w mieszaninie acetonu i etanolu lub samego acetonu. Fuksyna wykorzystywana była do barwienia negatywowego rozmazu. Metoda ta może być zmodyfikowana do barwienia skrawków tkanek.

2) Modyfikacja Jensen’a: metoda ta polega na zastosowaniu fioletu metylowego jako podstawowego barwnika oraz jodu i jodku potasu w wodzie jako utrwalacz. Alkohol absolutny wykorzystywany jest do odbarwiania próbki, a czerwień obojętna jako kontrast.

3) Modyfikacja Weigert’a: modyfikacja ta jest szczególnie przydatna do barwienia skrawków tkanek. Podstawowym barwnikiem jest goryczka karbolowa.

4) Modyfikacja Preston’a i Morrell’a: podstawowym barwnikiem stosowanym w tej modyfikacji jest szczawian amonu- fiolet krystaliczny. Rozmaz przemywany jest płynem Lugola, a następnie traktowany jodem. Odbarwienie przebiega z wykorzystaniem mieszaniny jod-aceton, a jako kontrast wykorzystuje się rozcieńczony roztwór  fuksyny karbolowej. Metodę zmodyfikowano tak, by zmniejszyć drażniący jod w postaci aerozolu, co wywołano poprzez zmniejszenie stężenia jodu do jednej dziesiątej i skrócenie czasu odbarwienia do 10 sekund [6]. 

Barwienie kwasooporne

W 1882 roku Robert Koch donosząc się do odkrycia prątków gruźlicy, opisał ich wygląd na podstawie złożonej procedury barwienia. W tym samym czasie kilku innych badaczy (Ehrlich, Ziehl, Rindfleisch i Neelsen), chcąc poprawić metody Kocha, wprowadzili zmiany do odczynników i samej procedury. Franz Ziehl jako pierwszy zastosował fenol jako utrwalacz, a Fredrich Neelsen zachował utrwalacz zaproponowany przez Ziehl’a, ale zmienił podstawowe barwienie fuksyną. Metoda ta stała się znana jako metoda Ziehl-Neelsena na początku pierwszej połowy 1890 roku.

W metodzie tej wykorzystywane jest ciepło, które ułatwia przedostawanie się barwnika w głąb woskowej ściany komórkowej trudno-barwiących się komórek. Wykorzystywanie ciepła w metodzie jest powodem dla którego określana jest ona mianem barwienia na gorąco” [12]. Metoda znalazła zastosowanie w medycynie klinicznej do potwierdzania lub wykluczania obecności prątków gruźlicy (Mycobacterium tuberculosis [12].

W diagnostyce gruźlicy materiał pobrany od pacjenta badany jest metodą rozmazu oraz hodowli. Materiałem do badań może być np. wycinek z oskrzeli (pobrany ze zmian uwidocznionych podczas bronchoskopii) lub próbki zgromadzone podczas zabiegu operacyjnego (fragmenty tkanki). Z racji tego, iż gruźlica może zajmować różnorodne narządy, w niektórych sytuacjach do badania można posłać praktycznie każdy materiał biologiczny pobrany od chorego (z wykluczeniem kału, który zawiera dużo innych bakterii, uniemożliwiając tym samym wiarygodną diagnostykę) [14].