Akceptuję
W ramach naszej witryny stosujemy pliki cookies w celu świadczenia państwu usług na najwyższym poziomie, w tym w sposób dostosowany do indywidualnych potrzeb. Korzystanie z witryny bez zmiany ustawień dotyczących cookies oznacza, że będą one zamieszczone w Państwa urządzeniu końcowym. Możecie Państwo dokonać w każdym czasie zmiany ustawień dotyczących cookies. Więcej szczegółów w naszej Polityce Prywatności

Zamknij X
Dygestorium
Strona główna Artykuły
Dodatkowy u góry
Labro na dole

Izolacja oraz analiza wybranych parametrów płytek krwi cz. 2

Płytki krwi (trombocyty) są najmniejszymi elementami morfotycznymi krwi, nieposiadającymi jądra komórkowego, które odgrywają bardzo istotną rolę w procesie hemostazy. W związku z tym stanowią ważny obiekt licznych badań in vitro (ich głównym celem jest m.in. wyselekcjonowanie preparatów wykazujących działanie przeciwpłytkowe) [1]. Oprócz zaangażowania w fizjologiczne procesy hemostazy, płytki krwi biorą również udział w procesach patologicznych (związane są m.in. z chorobami układu naczyniowego czy w procesy tworzenia przerzutów nowotworowych) [5], [9].


Izolacja płytek krwi metodą przemywania

 

Osocze bogatopłytkowe (PRP) otrzymane tak jak opisano powyżej, przeniesiono do probówki polipropylenowej, do której dodano ACD i PGE1. Próbkę wirowano przy 650 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a otrzymane po wirowaniu osocze usunięto. Płytki zawieszono w 10 ml buforu Jamieson'a (tj. 5,5 mM [D]-glukoza-1,28 mM NaCl-4,26 mM Na2HPO4-7,46 mM NaH2PO4-4,77 mM cytrynian sodu-2,35 kwas cytrynowy-0,35% BSA, pH 6,5), a następnie wirowano przy 500 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Otrzymany supernatant odrzucono, a osad ponownie zawieszono w wolnym od Ca2+ buforze Hepes-Tyroda [18],[19].

 

Otrzymywanie krwinek płytkowych (wg Rendu F., i wsp., 1983)

Zasada metody:

W metodzie tej należy tak dobrać warunki wirowania, by w trakcie wirowania próbki erytrocyty i leukocyty krwi osadzały się, a płytki krwi pozostały w osoczu, tworząc tzw. osocze bogatopłytkowe (ang. platelet rich plasma- PRP).

Zawieszone w osoczu płytki oczyszczane są od pozostałych komórek, a następnie oddziela od osocza za pomocą różnych metod laboratoryjnych (najczęściej wykorzystywana jest metoda wirowania). Białko płytkowe oznacza się z kolei zmodyfikowaną metodą Lowry’ego bądź też metodą mikrobiuretową. W celu określenia ilości płytek krwi wykorzystuje się stolik Thoma-Zeissa (inaczej komora zliczeniowa Thoma). Liczba płytek krwi w osoczu (lub zawiesinie) oznaczana jest z wykorzystaniem metody spektrofotometrycznej (przy λ= 800 nm) [2].

Materiał do oznaczenia: krew świni (50-200 ml), pobrana na 0,2 M roztwór cytrynianu sodowego (krew nie może zostać pobrana na heparynę).

 

Wykonanie oznaczenia:

Otrzymywanie osocza bogatopłytkowego: krew należy odwirować przy 1000 obr./min. (15 minut). Osadzone w trakcie wirowania erytrocyty i leukocyty należy odrzucić, i bardzo ostrożnie ściągnąć supernatant (osocze bogatopłytkowe), który należy zachować do badania agregacji [2].

 

Wybrane metody otrzymywanie płytek krwi z osocza bogatopłytkowego:


a) Metoda frakcjonowanego wirowania i przemywania płytek: osocze należy odwirować przez 20 minut przy 6000 obr./min. Otrzymany supernatant odrzucić, pozostawiając otrzymany na dnie probówki osad płytek zanieczyszczonych domieszką erytrocytów i leukocytów. Osad zawiesić w niewielkiej ilości (10-20 ml) buforu Tyroda (tj.: 10 mM HEPES-140 mM NaCl-3 mM KCl- 0,5 mM MgCl2- 5 mM NaHCO3- 10 mM glukoza, pH=7,4). Próbkę odwirować (1000 obr./min., 10 minut). Osadzone po wirowaniu erytrocyty i leukocyty należy odrzucić, a zawiesinę płytek w roztworze przemywającym ponownie odwirować (6000 obr./min., 20 minut), w celu osadzenia płytek. Otrzymany osad płytek ponownie zawiesić w buforze Tyroda 910 ml). Próbka może być wykorzystana do pomiaru aktywacji krwinek płytkowych [2].

b) Metoda wirowania w gradiencie stężenia albuminy (wg Walsh, 1972): osocze bogatopłytkowe (w objętości ok. 5-8 ml) należy nawarstwić na 2-centymetrować warstwę 25% roztworu BSA, znajdującego się w probówce wirówkowej. Następnie należy lekko zamieszać górną (0,5-centymetrową) warstwę roztworu BSA, po czym odwirować próbkę przez 30 minut przy 6000 obr./minutę). Po wirowaniu erytrocyty osadzają się na dnie probówki, z kolei płytki krwi znajdują się w górnej warstwie roztworu BSA. Warstwę płytek należy ostrożnie ściągnąć, używając w tym celu pipety.

c) Metoda wirowania z olejem silikonowym (wg Feinberg i wsp., 1974): metoda wykorzystywana jest do oddzielania płytek krwi od osocza, a podczas jej przebiegu osocze bogatopłytkowe (ok. 5-8 ml) nawarstwiane jest na 1 ml oleju silikonowego. Następnie próbka poddawana jest odwirowaniu przez 15 minut przy 6000 obr./min. Po wirowaniu otrzymuje się osad płytek, który oddzielony jest od osocza warstwą oleju silikonowego [2].

d) Wirowanie w gradiencie stężenia metrizamidu (wg Rendu, 1983): próbkę osocza bogatopłytkowego należy nanieść w ilości ok. 8 ml na gradient metrizamidu (10%/25%) znajdującego się w probówce wirówkowej. Tak przygotowaną próbkę odwirować przy 2600 obr./min. przez 12 minut, po wirowaniu usunąć warstwę PRP wraz z górną i dolną warstwą metrizamidu. Do pozostałej objętości próbki (0,5-1 ml) należy dodać bufor przemywający A (tj.: 140 mM NaCl-5 mM KCl-12 mM cytrynian sodu- 10 mM glukoza- 12,5 mM sacharoza, pH=6.0). Bufor należy dodać w takiej ilości by otrzymać wyjściowa objętość PRP. Otrzymaną zawiesinę płytek należy nanieść na następny gradient metrizamidu (10%/25%), ponownie odwirować i usunąć górną i dolną warstwę (jak wyżej), a otrzymane płytki krwi zawiesić w buforze Tyroda (również jak wyżej).

e) Filtracja żelowa (wg Walkowiak i wsp., 1989): na kolumnę wypełnioną żelem Sepharose 4B (o wymiarach 1,5 x 30cm, przemytą buforem Tyroda) należy nanieść od 5 do 10 ml osocza bogatopłytkowego, po czym przeprowadzić elucję buforem Tyroda (z szybkością 15 ml/min). W trakcie elucji należy rejestrować absorbancję próbki, mierzoną przy długości fali λ= 230 lub 280 nm. W trakcie elucji jako pierwsze z próbki wymywane zostają płytki krwi, a następnie białka osocza [2].

 

Wykrywanie przeciwciał płytkowych

 

W przypadku wykrywania przeciwciał płytkowych najczęściej wykorzystywane są metody oparte na zasadzie testu antyglobulinowego, gdzie surowicę, w której poszukuje się przeciwciał poddaje się inkubacji z allogenicznymi płytkami krwi, a następnie z surowicą antyglobulinową, która jest sprzężona z fluorochromem lub enzymem. W przypadku, gdy surowica antyglobulinowa jest znakowana fluoresceiną (tzw. test immunofluorescencyjny) wtedy wyniki badań ocenia się z wykorzystaniem mikroskopu fluorescencyjnego lub cytometru przepływowego. Z kolei, gdy surowica sprzężona jest z enzymami np. fosfatazą zasadową lub peroksydazą (tzw. test immunoenzymatyczny) to wyniki badań ocenia się w spektrofotometrze.

 


Tagi: trombocyty, płytki krwi, ziarnistości, osocze bogatopłytkowe, PRP, przeciwciała płytkowe, okluzja, utrwalanie, cytometr przepływowy, liofilizacja, frakcjonowanie, megakariocyt, propłytki, proliferacja, trombopoetyna
Drukuj PDF
wstecz Podziel się ze znajomymi

Recenzje



Informacje dnia: Drżące nanorurki Naukowcy znaleźli sposób na recykling betonu ADHD zdiagnozowano u co dziewiątego dziecka w USA Testy na obecność HPV Do środowiska trafiło ponad 1 mld komarów GMO Może to owady uratują nas przed zwałami plastiku Drżące nanorurki Naukowcy znaleźli sposób na recykling betonu ADHD zdiagnozowano u co dziewiątego dziecka w USA Testy na obecność HPV Do środowiska trafiło ponad 1 mld komarów GMO Może to owady uratują nas przed zwałami plastiku Drżące nanorurki Naukowcy znaleźli sposób na recykling betonu ADHD zdiagnozowano u co dziewiątego dziecka w USA Testy na obecność HPV Do środowiska trafiło ponad 1 mld komarów GMO Może to owady uratują nas przed zwałami plastiku

Partnerzy

GoldenLine Fundacja Kobiety Nauki Job24 Obywatele Nauki NeuroSkoki Portal MaterialyInzynierskie.pl Uni Gdansk MULTITRAIN I MULTITRAIN II Nauki przyrodnicze KOŁO INZYNIERÓW PB ICHF PAN FUNDACJA JWP NEURONAUKA Mlodym Okiem Polski Instytut Rozwoju Biznesu Analityka Nauka w Polsce CITTRU - Centrum Innowacji, Transferu Technologii i Rozwoju Uniwersytetu Akademia PAN Chemia i Biznes Farmacom Świat Chemii Forum Akademickie Biotechnologia     Bioszkolenia Geodezja Instytut Lotnictwa EuroLab

Szanowny Czytelniku!

 
25 maja 2018 roku zacznie obowiązywać Rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) 2016/679 z dnia 27 kwietnia 2016 r (RODO). Potrzebujemy Twojej zgody na przetwarzanie Twoich danych osobowych przechowywanych w plikach cookies. Poniżej znajdziesz pełny zakres informacji na ten temat.
 
Zgadzam się na przechowywanie na urządzeniu, z którego korzystam tzw. plików cookies oraz na przetwarzanie moich danych osobowych pozostawianych w czasie korzystania przeze mnie ze strony internetowej Laboratoria.net w celach marketingowych, w tym na profilowanie i w celach analitycznych.

Kto będzie administratorem Twoich danych?

Administratorami Twoich danych będziemy my: Portal Laboratoria.net z siedzibą w Krakowie (Grupa INTS ul. Czerwone Maki 55/25 30-392 Kraków).

O jakich danych mówimy?

Chodzi o dane osobowe, które są zbierane w ramach korzystania przez Ciebie z naszych usług w tym zapisywanych w plikach cookies.

Dlaczego chcemy przetwarzać Twoje dane?

Przetwarzamy te dane w celach opisanych w polityce prywatności, między innymi aby:

Komu możemy przekazać dane?

Zgodnie z obowiązującym prawem Twoje dane możemy przekazywać podmiotom przetwarzającym je na nasze zlecenie, np. agencjom marketingowym, podwykonawcom naszych usług oraz podmiotom uprawnionym do uzyskania danych na podstawie obowiązującego prawa np. sądom lub organom ścigania – oczywiście tylko gdy wystąpią z żądaniem w oparciu o stosowną podstawę prawną.

Jakie masz prawa w stosunku do Twoich danych?

Masz między innymi prawo do żądania dostępu do danych, sprostowania, usunięcia lub ograniczenia ich przetwarzania. Możesz także wycofać zgodę na przetwarzanie danych osobowych, zgłosić sprzeciw oraz skorzystać z innych praw.

Jakie są podstawy prawne przetwarzania Twoich danych?

Każde przetwarzanie Twoich danych musi być oparte na właściwej, zgodnej z obowiązującymi przepisami, podstawie prawnej. Podstawą prawną przetwarzania Twoich danych w celu świadczenia usług, w tym dopasowywania ich do Twoich zainteresowań, analizowania ich i udoskonalania oraz zapewniania ich bezpieczeństwa jest niezbędność do wykonania umów o ich świadczenie (tymi umowami są zazwyczaj regulaminy lub podobne dokumenty dostępne w usługach, z których korzystasz). Taką podstawą prawną dla pomiarów statystycznych i marketingu własnego administratorów jest tzw. uzasadniony interes administratora. Przetwarzanie Twoich danych w celach marketingowych podmiotów trzecich będzie odbywać się na podstawie Twojej dobrowolnej zgody.

Dlatego też proszę zaznacz przycisk "zgadzam się" jeżeli zgadzasz się na przetwarzanie Twoich danych osobowych zbieranych w ramach korzystania przez ze mnie z portalu *Laboratoria.net, udostępnianych zarówno w wersji "desktop", jak i "mobile", w tym także zbieranych w tzw. plikach cookies. Wyrażenie zgody jest dobrowolne i możesz ją w dowolnym momencie wycofać.
 
Więcej w naszej POLITYCE PRYWATNOŚCI
 

Newsletter

Zawsze aktualne informacje