W zależności od mierzonego parametru związanego z żywotnością komórek jądrzastych, powszechnie stosowane są m.in.: metody oparte na pomiarze aktywności metabolicznej komórki (np. test MTT, XTT, WST-1, PrestoBlue™), lizie komórki bądź uszkodzeniu błony plazmatycznej (test dehydrogenazy mleczanowej, barwienie błękitem trypanu). W badaniach żywotności wielu typów komórek dużym zainteresowaniem cieszy się szeroko stosowana technika tzw. cytometrii przepływowej. Metoda ta wykorzystuje różnorodne znaczniki fluoroscencyjne: jodek propidyny, kalceinę, karboksyfluoresceinę i wiele innych. Spośród znanych metod najbardziej obiecującą jest technika barwienia płytek krwi estrem kalceiny, a także pomiar przy zastosowaniu cytometrii przepływowej [1].

Dzięki cytometrii przepływowej możliwy jest szybki pomiar liczby komórek, który wykonywany jest podczas ich liniowego przepływu w komorze pomiarowej. W metodzie tej strumień komórek przepływa przed układami rejestrującymi (fotokomórkami lub fotopowielaczami). Dzięki temu za pomocą cienkiej wiązki spolaryzowanego światła lasera dochodzi do oświetlenia pojedynczych komórek. Komórki te rozpraszają, załamują, odbijają, a następnie absorbują światło przechodzące przez komorę pomiarową, powodując tym samym chwilowe zmiany sygnału elektrycznego w elementach rejestrujących. Metoda cytometrii przepływowej umożliwia pomiar aktywności płytek krwi, a także monitorowanie np. terapii przeciwpłytkowej. Co więcej z jej wykorzystaniem możliwe jest ocenienie również interakcji zachodzących między płytkami i leukocytami. Ponadto metoda pozwala także na wykrywanie nabytych i wrodzonych defektów trombocytów [12].

Otrzymywanie płytek z pełnej krwi ludzkiej [20]

W celu przeprowadzenia procedury izolacji płytek krwi z pełnej krwi ludzkiej konieczne jest zapoznanie się z kilkoma kluczowymi elementami, które mogą znacząco wpłynąć zarówno na wydajność procedury, jak również na same komórki. Znanych jest wiele leków mogących zakłócać badania i analizę funkcji płytek. Wśród nich wymienia się aspirynę, leki anty-histaminowe czy niesteroidowe leki zapalne. Bardzo ważne jest, aby potencjalni dawcy krwi nie przyjmowali tego typu środków, co najmniej 2 tygodnie przed pobraniem krwi. Zaleca się by płytki pobierane były i przechowywane w polipropylenowych, polietylenowych lub policarbonylowych pojemnikach. Krew oraz nienaruszone płytki powinny być przetwarzane w temperaturze pokojowej lub 37⁰C. Co więcej krew jest płynem ustrojowym i powinna być traktowana, jako potencjalne zagrożenie biologiczne w związku, z czym wymagane jest zawsze noszenie odpowiedniej odzieży ochronnej oraz utylizowanie próbek zgodnie z przepisami [20].

Frakcjonowanie krwi

Najważniejszym krokiem w procedurach frakcjonowania krwi jest odpowiednie pobranie pełnej krwi oraz przygotowanie osocza bogatopłytkowego (PRP) przez odwirowanie próbki. Warunki odwirowywania mogą się różnić w zależności od metody (np. wirowanie od 800 x g przez 5 minut do 100 x g przez 20 minut), jednakże ostatecznie i tak otrzymuje się dobrze odseparowane składniki. Krew powinna być pobierana do plastikowej probówki zawierającej 1/10 objętości bufor CPD (cytrynian-fosforan-dekstroza, tj.: 16 mM kwas cytrynowy, 90 mM cytrynian sodu, 16 mM NaH₂PO₄, 142 mM dekstroza, pH 7,4). Objętość potrzebnej krwi zależy od doświadczenia, aczkolwiek zazwyczaj 40-45 ml krwi (w średnich wynikach) otrzymuje się 1-3 x 10⁹ płytek krwi [20].