Po przeprowadzonej elektroforezie, wykonano zdjęcia żelu analizowanego w świetle UV, za pomocą Gel-Doc™XR (Bio Rad). Za pomocą starterów Hel6632L, Hel6632R,w reakcji PCR, o podanym profilu termicznym uzyskano produkty zobrazowane na rysunku nr. 1. Zamplifikowane produkty mają masę zawartą między 600 a 700 par zasad. Uzyskano amplifikację w wszystkich badanych szczepach Lb. helveticus. Produkty uzyskano u szczepów T105, 141, T104, K1, B734, T103, 80, DMS, T15, T80, 199, 159.

W przypadku pary starterów Hel7565L, Hel7565R, zidentyfikowano produkty o masie mieszczącej się pomiędzy 500 a 600 nukleotydów. Startery okazały się być specyficzne dla fragmentów sekwencji szczepów Lb. helveticus T105, 141, T104, B734, T103, 80, DMS, T80 oraz 159.W przypadku szczepów K1, T15 oraz 199 nie wystąpiła amplifikacja. Dodatkowo, u szczepu Lb. helveticus T104 zauważono inny profil genetyczny, prążek znajduje się wyżej co wskazuje na jego większą masę, powyżej 600 par zasad (Rys. 2).

Reakcja PCR z starterami Hel3552L, Hel3552R wykazała iż poszukiwana sekwencja helwetycyny J, komplementarna z tymi starterami, znajduje się u szczepów T104, B734, T103, 80, T15, natomiast u szczepów T80, 199, 159, DMS, K1, 141, T105 brakuje powyższego produktu amplifikacji (Rys. 3).

Przy użyciu starterów Hel8220L, Hel8220R, otrzymano produkty w reakcji PCR z szczepami T105, 141, T104, K1, T15, 159. Rozdział elektroforetyczny pozwolił określić, że masa produktu zawiera się między 200, a 100 nukleotydów. W przypadku bakterii Lb. helveticus B734, T103, 80, DMS, T80, 199, brak jest produktów, co tłumaczy się brakiem sekwencji komplementarnej do pary starterów Hel8220 (Rys. 4).

Wyniki sekwencjonowania oraz opracowanie bioinformatyczne

Wyniki wykazują, że istnieją różnice w organizacji loci genu lhv w badanych szczepach Lb. helveticus. Startery w tej pracy były zaprojektowane do sekwencji regionu ORF2 i ORF3. Para starterów Hel6632L, Hel6632R dała pozytywne wyniki u wszystkich dwunastu badanych szczepów. Natomiast w przypadku starterów Hel7565 L i R stwierdzono wystąpienie specyficznej sekwencji u dziewięciu szczepów, dodatkowo u Lb. helveticus T104 wystąpił inny profil genetyczny, uzyskano aplifikon o większej masie niż pozostałe. Największe zróżnicowanie uzyskano w reakcji PCR z wykorzystaniem starterów Hel8220 i Hel3552. Po amplifikacji z powyższymi starterami, trzy rodzaje genotypów zostały opisane. U ośmiu szczepów Lb. helveticus K1, T159, B734, T103, T104, T105, T15 i DSM zostały wykryte sekwencje strukturalne i sygnałowe peptydu. Trzy szczepy Lb. helveticus T199, T80 oraz 80 zawierały gen sygnału peptydowego, jednakże nie zidentyfikowano genu strukturalnego helwetycyny J, sugeruje to występowanie u nich odmiennej sekwencji lhv od tej zdeponowanej w GenBanku (M59360.1). Szczep Lb. helveticus 141 nie posiadał sygnału peptydowego, lecz obecny był gen strukturalny helwetycyny. Amplifikacja przy wszystkich starterach wystąpiła tylko u szczepu Lb. helveticus T104, dlatego też do dalszych badań wybrano sekwencję nukleotydową genu lhv. Dzięki produktom reakcji pochodzącym od różnych starterów udało się uzyskać sekwencję helwetycyny występującą u Lb. helveticus szczepu T104. Sekwencja ta liczy sobie 1216 nukleotydów, otrzymała numer KF860892.1 w bazie danych GenBank NCBI.

1 agaggtggtg ccaatgactg tgcaataagg aaaaagagag gtgaagaaga aatcatggat

61 attcatgatt acgttgaatt gatagcttta gcgttttggg ctatcagtgt tgtaagtgtc

121 ggtatcttga gtcatgttca ttttaagaat aagaggctgg aacagtttcg tattactgct

181 gatgatttga tgaaaaacta cgttggtttg tacaacaaag aaagtttagc cagcgatcaa

241 aaaatcaatc ggattgtcaa tgcagtagta gacggactag aagctaaagg ttttaaagtg

301 gaagaccaag atgtaaagga tatttttgca aaggtcgcaa aaattattaa tgaaaattct

361 tctaagtagg aagatagaga ttttttcgga ggttttatta tgaagcattt aaatgaaaca

421 actaatgtta gaattttaag tcaatttgat atggatactg gctatcaagc agtagttcaa

481 aaaggcaatg taggttcaaa atatgtatat ggattacaac ttcgcaaagg tgctactact

541 atcttgcgtg gttaccgtgg aagtaaaatt aataacccta ttcttgaatt atctggtcaa

601 gcaggtggtc acacacagac atgggaattt gctggtgatc gtaaagacat taatggtgaa

661 gaaagagcag gtcaatggtt tataggtgtt aaaccatcga aaattgaagg aagcaaaatt

721 atttgggcaa agcaaattgc aagagttgat cttagaaatc aaatgggacc tcattattca

781 aatactgact ttcctcgatt atcctacttg aatcgcgccg gttctaatcc atttgctggt

841 aataagatga cgcatgccga agccgcagta tcacctgatt atactaagtt tttaattgct

901 actgttgaaa ataactgtat tggtcatttt actatataca atttagatac aattaatgaa

961 aaacttgatg aaaagggaaa tagtgaagat gttaatctcg aaactgttaa atacgaagat

1021 agttttatca ttgataattt atatggtgat gataataatt ctattgtaaa ttcaattcaa

1081 gggtatgatt tggataatga tggaaatatt tatatttcca gtcaaaaagc gccagatttt

1141 gatggctctt attatgcaca tcataagcag attgttaaga ttccatatta tgctcggtct

1201 aaagaaagcg aagacca

Otrzymana sekwencja DNA była podobna do lhvJ (JOERGER I KLAENHAMMER, 1990), w dwóch fragmentach od nukleotydu 55 do 369 oraz od 400 do 1217. Analogiczne także były sekwencje miejsca wiązania rybosomu i sygnały peptydowego. To co różni te dwie sekwencje to ich długość, gen lhvT104 jest krótszy o 183 nukleotydy od genu lhvJ. W 51 nukleotydzie kodującej sekwencji DNA, wykryto niesynonimiczny polimorfizm pojedynczego nukleotydu (SNP), który doprowadził do zamiany waliny na alaninę w strukturze helwetycyny. SNP zostały także zlokalizowane w nukleotydowej sekwencji kodującej sygnał peptydowy helwetycyny. W pozycji 55 nukleotydu oraz 72 znajdowały się synonimiczne polimorfizmy pojedynczego nukleotydu. Porównanie sekwencji sygnału peptydowego z genomami innych Lactobacillus, wykazało że zaobserwowany polimorfizm u Lb. helveticus T104 był wyjątkowy. Rysunek nr 5 przedstawia sekwencję peptydu sygnałowego występującą u  Lb. helveticus T104.