W wyniku analizy filogenetycznej otrzymano drzewo (Rys. 6), dla sekwencji genu helwetycyny w grupie rodzaju Lactobacillus, w którym można wyróżnić dwie oddzielne gałęzie. Gen lhvT104, który był przedmiotem badań, był blisko spokrewniony z genem helwetycyny J, obecnej u Lb. helveticus M59360, natomiast gen kodujący helwetycynę pochodzący z Lb. helveticus DPC 4571, był zbliżony do genów występujących u gatunków Lb. acidophilus oraz Lb. amylovorus. Na podstawie otrzymanej sekwencji stworzono za pomocą narzędzi bioinformatycznycznych (Modeller), graficzny model helwetycyny, pokazany na rysunku nr 7.

Dyskusja

Lactobacillus helveticus, który zdominował różnorodne nisze ekologiczne, głównie fermentowane produkty mleczne, ale także przewody pokarmowe, wykształcił szczególne cechy dla których tak chętnie wykorzystywany jest przemysłowo (SLATTERY I IN., 2010; AZCARATE – PERIL I KLAENHAMMER, 2010). Poza zaletami gatunku Lb. helveticus jakimi jest najlepszy system proteolityczny (CEP)oraz wynikające z tego jego ważne znaczenie przemysłowe. Co więcej, biosynteza bakteriocyny przez Lb. helveticus w technologii żywności, ma  szczególną wagę, jaką jest unikanie zakażeń w produkowanych serach. Przeprowadzone badania miały na celu zwiększenie informacji na temat zróżnicowania helwetycyny. Pozwoliłoby to na rozwinięcie sposobów jej wykorzystania oraz ułatwiłoby dobór idealnych mikroorganizmów przemysłowych. W wyniku niniejszej pracy, w oparciu o reakcję PCR, wyizolowano i zsekwencjonowano operon helwetycyny, polskiego szczepu Lb. helveticus T104, który otrzymał numer KF860892.1 w bazie danych NCBI GenBank. Uzyskane wyniki potwierdzają istnienie zróżnicowania u wykorzystanych dwunastu gatunków, w obrębie genu helwetycyny.

Pomimo licznych zalet i możliwości wykorzystania, helwetycyna J jest jedną z najmniej poznanych bakteriocyn. Była odkryta  w 1986, przez JOERGER I KLAENHAMMER, podczas badań nad szczepem Lb. helveticus 481 oraz później opisana i zsekwencjonowana (JOERGER I KLAENHAMMER, 1986; 1990). Opracowali oni molekularne zorganizowanie operonu helwetycyny J, rozmieszczenie otwartych ramek odczytu, oraz przebieg transkrypcji. W późniejszych latach odkrywano nowe rodzaje helwetycyn, które różniły się od siebie właściwościami oraz sekwencją. W 1992 r. opisano helwetycynę V1829, wpływającą tylko na wskaźnikowe szczepy Lb. helveticus i Lb delbrueckii subsp. bulgaricus (VAUGHAN I IN., 1992), natomiast w 1996 r. bakteriocynę o szerszej aktywności antybakteryjnej, wyizolowanej z Lb. helveticus CNRZ 450 (THOMPSON I IN.,1996). Helwetycyna 51 wyizolowana z Lb. helveticus G51 w 2001 roku, wyróżniała się silną aktywnością oraz dużą odpornością na proteinazy, produkowane przez szczepy wrażliwe lub oporne na tą bakteriocynę (BONADE I IN., 2001). Obecnie panuje nowa metagenomowa tendencja badań bakteriocyn, takie wyniki otrzymano także dla helwetycyny. ZHANG I IN. wyizolowali 108 unikatowych sekwencji helwetycyny, produkowanej przez bakterie zamieszkujące różne nisze tradycyjnych chińskich produktów fermentowanych, dodatkowo próbki pobrano z różnych miejsc geograficznych. Ponadto stwierdzono, że w jednej próbce znajduje się ogromne zróżnicowanie helwetycyny J, co świadczy o tym, że żywność fermentowana tworzy niezwykle cenne źródło genów (ZHANG I IN., 2013).

Tematyka niniejszych badań, także podkreśla wagę istnienia ogromnego zróżnicowania struktury i sekwencji helwetycyny, również wśród polskich szczepów Lb. helveticus. Zaprojektowane startery okazały się specyficzne wobec sekwencji helwetycyny J z 1986 roku, jednakże pozwoliły na uzyskanie różnorodnych wyników. Otrzymana sekwencja lhvT104, o długości 1216 nukleotydów, jest krótsza od sekwencji lhvJ, która ma 1399 nukleotydów (JOERGER I KLAENHAMMER, 1990). Natomiast ZHANG I IN. uzyskali fragment DNA mający 906 par zasad (ZHANG I IN., 2013). Sekwencja DNA uzyskana w tej pracy, jest identyczna do sekwencji Joerger’a i Klaenhammer’a w dwóch odcinkach nukleotydów, od 55 do 369 oraz od 400 do 1217, zmianie nie uległo położenie miejsca wiązania rybosomu i sygnału peptydowego (JOERGER I KLAENHAMMER, 1990). Niemniej jednak odkryto występowanie polimorfizmów pojedynczego nukleotydu w sekwencji lhvT104.  Uzyskane wyniki w tej pracy, wskazują na inną organizację loci lhv, w badanych szczepach, co więcej występowanie polimorfizmów i inna organizacja molekularna pozwoliła na zakwalifikowanie jej jako odmienną sekwencję DNA. LOMBARDI I IN. zidentyfikowali dzięki użyciu metod genotypowania i fenotypowania 67 szczepów Lb. helveticus izolowanych z kultur starterowych serwatki  i serów, a niniejsza praca wskazuje na prawdopodobieństwo występowania wielu różnych szczepów produkujących helwetycynę, w każdej niszy specyficznej dla tego gatunku (LOMBARDI I IN., 2002).