|
Zamknij X
|
Izolacja genomowego DNA
Przed wykonaniem izolacji, hodowlę przeszczepiono i inkubowano w 37°C, przez dobę. Po całonocnej hodowli, pobrano 3 ml i zwirowano z prędkością (8000 rpm/4°C/5 min). Następne etapy były przeprowadzane na lodzie. Izolację DNA wykonano za pomocą mieszanin, których głównym składnikiem był fenol i chloroform, według metody odczynnikowej (SENGÜVEN I IN., 2014). Izolację wykonano dwukrotnie.
Bezpośrednio po izolacji DNA wykonano analizę jakościową i ilościową materiału, z użyciem spektrofotometru NanoDrop, mierzącym absorbancję w przedziale od 230 do 320 nm. Wyzerowano spektrofotometr wodą dejonizowaną, w której zostało zawieszone DNA. Następnie naniesiono pipetą 1μL roztworu DNA na spektrofotometr, pobranego kolejno z probówek trzymanych na lodzie. Po każdym pomiarze wyczyszczono okienko aparatu. Stosunek absorbancji A260/A280, wynoszący od 1,7-2,0, wskazuje na wystarczające oczyszczenie preparatu. Do dalszych analiz wybrano próbki o najlepszej czystości oraz sporządzono rozcieńczenia 50 ng/µl.
PCR
Z wykorzystaniem sekwencji helwetycyny J, zdeponowanej w NCBI GenBank, zaprojektowano startery specyficzne do genu kodującego helwetycyne J (Tab. 1). Startery zaprojektowano tak, aby amplikony nie nachodziły na siebie oraz aby można było złożyć cały operon helwetycyny J, o długości 3300 nt. Nazwa starterów to analogicznie: hel1- liczba porządkowa, 552- to długość produktu danej pary starterów, L, R – położenie na amplikonie w konfiguracji 5’-3’.
Tabela 1. Startery.
Pelet oligonukleotydów, zwirowano, zalano odpowiednią ilością 10 mM Tris-HCl o pH 8, pozostawiono na 3 minuty, a następnie zworteksowano. Tak przygotowane roztwory wyjściowe starterów, rozcieńczano do reakcji w proporcjach: 2 µl startera + 18 µl buforu. Do reakcji użyto DreamTaq PCR Master Mix (2X) (Thermo Scientific), zawierające polimerazę DreamTaq DNA, zoptymalizowany DreamTaq bufor, MgCl2 oraz dNTP. Składniki reakcji PCR na jedną próbkę:12 µl Master Mix, po 1 µl startera R i L, 1 µl materiału DNA, 7 µl wody wolnej od nukleaz. Do każdej pary starterów warunki reakcji zostały zoptymalizowane, poprzez zmiany w liczbie cykli reakcji, zmiany w temperaturze przyłączania starterów, czy wydłużeniu czasu elongacji. Dla Hel3552L, Hel3552R wykonano 30 cykli składających się na: denaturacja początkowa 94°C przez 5 minut, denaturacja właściwa 94°C przez 30 sekund, przyłączanie starterów 57°C przez 30 sekund, elongacja 72°C przez 2 minuty oraz wydłużanie końcowe 72°C przez 10 minut. Analogicznie dla Hel6632L, Hel6632R 94°C – 5 min, 94°C – 30 s, 48,7°C – 30 s, 65°C – 3 min, 65°C – 3 min, dla Hel7565L, Hel7565R 94°C – 10 min, 94°C – 30 s, 46°C – 30 s, 72°C – 2 min, 72°C – 7 min, dla Hel8220L, Hel8220R 94°C – 10 min, 94°C – 30 s, 49°C – 30 s, 72°C – 2 min, 72°C – 10 min. Reakcje przebiegały w termocyklerze (SensoQuest labcycler).
Rozdział elektroforetyczny
Po przeprowadzeniu reakcji PCR, próbki rozdzielano na żelu agarozowym 1%, z dodatkiem bromku etydyny. Elektroforezę prowadzono przy napięciu 80V, przez 1h 30 minut. Produkty reakcji PCR nakładano na żel wraz z buforem obciążającym DNA Gel Loading Dye (6x) (Thermo Scientific) oraz z markerem GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (Thermo Scientific).
Sekwencjonowanie
Po wizualizacji prążków pod światłem UV, otrzymane sekwencje nukleotydowe oznaczano stosując BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) oraz kapilarny system sekwencjonowania 3730 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). Sekwencje DNA opracowano za pomocą programu ClastalW oraz programu MEGA 5.0.
W wyniku izolacji metodą odczynnikową, wykonano pomiar czystości i jakości materiału genomowego w dwóch powtórzeniach. W tabeli nr 2 przedstawiono średnie wyniki z obu izolacji, uzyskane za pomocą spektrofotometru NanoDrop, mierzącym absorbancję w przedziale od 230 do 320 nm.
Tabela 2. Wyniki izolacji.
25 maja 2018 roku zacznie obowiązywać Rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) 2016/679 z dnia 27 kwietnia 2016 r (RODO). Potrzebujemy Twojej zgody na przetwarzanie Twoich danych osobowych przechowywanych w plikach cookies. Poniżej znajdziesz pełny zakres informacji na ten temat.
Zgadzam się na przechowywanie na urządzeniu, z którego korzystam tzw. plików cookies oraz na przetwarzanie moich danych osobowych pozostawianych w czasie korzystania przeze mnie ze strony internetowej Laboratoria.net w celach marketingowych, w tym na profilowanie i w celach analitycznych.
Administratorami Twoich danych będziemy my: Portal Laboratoria.net z siedzibą w Krakowie (Grupa INTS ul. Czerwone Maki 55/25 30-392 Kraków).
Chodzi o dane osobowe, które są zbierane w ramach korzystania przez Ciebie z naszych usług w tym zapisywanych w plikach cookies.
Przetwarzamy te dane w celach opisanych w polityce prywatności, między innymi aby:
dopasować treści stron i ich tematykę, w tym tematykę ukazujących się tam materiałów do Twoich zainteresowań,
dokonywać pomiarów, które pozwalają nam udoskonalać nasze usługi i sprawić, że będą maksymalnie odpowiadać Twoim potrzebom,
pokazywać Ci reklamy dopasowane do Twoich potrzeb i zainteresowań.
Zgodnie z obowiązującym prawem Twoje dane możemy przekazywać podmiotom przetwarzającym je na nasze zlecenie, np. agencjom marketingowym, podwykonawcom naszych usług oraz podmiotom uprawnionym do uzyskania danych na podstawie obowiązującego prawa np. sądom lub organom ścigania – oczywiście tylko gdy wystąpią z żądaniem w oparciu o stosowną podstawę prawną.
Masz między innymi prawo do żądania dostępu do danych, sprostowania, usunięcia lub ograniczenia ich przetwarzania. Możesz także wycofać zgodę na przetwarzanie danych osobowych, zgłosić sprzeciw oraz skorzystać z innych praw.
Każde przetwarzanie Twoich danych musi być oparte na właściwej, zgodnej z obowiązującymi przepisami, podstawie prawnej. Podstawą prawną przetwarzania Twoich danych w celu świadczenia usług, w tym dopasowywania ich do Twoich zainteresowań, analizowania ich i udoskonalania oraz zapewniania ich bezpieczeństwa jest niezbędność do wykonania umów o ich świadczenie (tymi umowami są zazwyczaj regulaminy lub podobne dokumenty dostępne w usługach, z których korzystasz). Taką podstawą prawną dla pomiarów statystycznych i marketingu własnego administratorów jest tzw. uzasadniony interes administratora. Przetwarzanie Twoich danych w celach marketingowych podmiotów trzecich będzie odbywać się na podstawie Twojej dobrowolnej zgody.
Dlatego też proszę zaznacz przycisk "zgadzam się" jeżeli zgadzasz się na przetwarzanie Twoich danych osobowych zbieranych w ramach korzystania przez ze mnie z portalu *Laboratoria.net, udostępnianych zarówno w wersji "desktop", jak i "mobile", w tym także zbieranych w tzw. plikach cookies. Wyrażenie zgody jest dobrowolne i możesz ją w dowolnym momencie wycofać.
Więcej w naszej POLITYCE PRYWATNOŚCI
Recenzje